Фотообои 5д: каталог с ценой и фото

Есть потребность?
Лучшая цена

Индивидуальная алмазная живопись | Diamond Pictures

{{имя}} {{#если вариант}} {{вариант}} {{/если}} {{{price_formatted}}} {{#if unit_price}} {{{Цена за единицу}}} {{/если}}

22 доллара.00 долларов США 32 доллара США

22 доллара США

Создайте алмазную картину на заказ из своей фотографии!

Heartful Diamonds теперь предлагает индивидуальный дизайн, нанесенный вручную.

Мы предлагаем 100% гарантию возврата денег за качество дизайна нестандартных изделий с бриллиантами.

Загрузите любое изображение со своего телефона или компьютера и выберите нужный размер и форму ромба .

Нарисованные от руки обычаи доступны только и исключительно в Heartful Diamonds. Никакая другая компания не будет предлагать эту услугу из-за того, что на каждую фотографию уходит много времени. Вот что отличает нас.

⭐ Бесплатные предварительные просмотры дизайна перед покупкой (просто спросите!).

⭐ Бесплатные улучшения фотографий и замена алмазных сверл.

⭐ Более 1000 5-звездочных отзывов от довольных клиентов.

Если вам нужны большего размера , посетите эту страницу.

Отправьте свою фотографию или дизайн для индивидуальной алмазной картины

22 доллара США 32 доллара США

22 доллара США

Следуйте нашему простому трехэтапному процессу

Найдите изображение, которое вы хотите превратить в индивидуальный дизайн.

Нажмите на текст «Загрузить изображение», чтобы открыть файлы изображений.

Если ваш снимок был сделан камерой телефона, перейдите в «Фотопленка», «Галерея» или в любое другое приложение для хранения изображений, которое вы используете.

В противном случае вы откроете некоторые параметры для поиска изображения в фотопленке или в локально сохраненных файлах на вашем телефоне или компьютере.

Выберите наилучший размер изображения и предпочитаемую форму ромба.

Чтобы убедиться, что вы выбрали наилучший размер, ознакомьтесь с нашей таблицей размеров, прокрутив страницу ниже.

Если вы впервые, у нас также есть информация о различиях для каждой формы ромба.

После того, как вы выбрали оба варианта, проверьте цену и нажмите кнопку «Добавить в корзину»!

Создадим алмазную картину по вашему дизайну!

После размещения заказа наши дизайнеры приступают к работе.

Разработка дизайна, печать и упаковка вашей великолепной алмазной картины займет до 7 рабочих дней.

После этого мы доставим его прямо к вашей двери – все, что вам нужно сделать, это сесть, расслабиться и ждать. Обещаем, все будет стоить!

Следуйте нашему простому трехэтапному процессу

Найдите изображение, которое вы хотите превратить в индивидуальный дизайн.

Нажмите на текст «Загрузить изображение», чтобы открыть файлы изображений.

Если ваш снимок был сделан камерой телефона, перейдите в «Фотопленка», «Галерея» или в любое другое приложение для хранения изображений, которое вы используете.

В противном случае вы откроете некоторые параметры для поиска изображения в фотопленке или в локально сохраненных файлах на вашем телефоне или компьютере.

Выберите наилучший размер изображения и предпочитаемую форму ромба.

Чтобы убедиться, что вы выбрали наилучший размер, ознакомьтесь с нашей таблицей размеров, прокрутив страницу ниже.

Если вы впервые, у нас также есть информация о различиях для каждой формы ромба.

После того, как вы выбрали оба варианта, проверьте цену и нажмите кнопку «Добавить в корзину»!

Создадим алмазную картину по вашему дизайну!

После размещения заказа наши дизайнеры приступают к работе.

Разработка дизайна, печать и упаковка вашей великолепной алмазной картины займет до 7 рабочих дней.

После этого мы доставим его прямо к вашей двери – все, что вам нужно сделать, это сесть, расслабиться и ждать.Обещаем, все будет стоить!

• Лучшее фото для загрузки

• Лучший размер для вашей фотографии

• Наиболее подходящая форма ромба

Использовать четкую (не размытую) фотографию

Алмазные картины имеют эффект мозаики, поскольку каждая цветовая «точка» может составлять большую часть исходной фотографии.Уже размытая фотография или изображение может стать еще более размытым.

Избегайте прямых солнечных лучей и сильных теней

Диапазон цветов, доступных для алмазных сверл, намного меньше по сравнению с цифровыми изображениями. Очень яркий солнечный свет или большие тени могут выглядеть неестественно.

Выбирайте крупный план, а не далекий

Мелкие детали лиц людей или домашних животных не могут быть воспроизведены реалистично из-за природы алмазных сверл, которые должны занимать больше места на «пиксель» цифровой фотографии.

Для лучшей детализации мы рекомендуем максимально возможный размер, который вы можете себе позволить, и готовы потратить время на его завершение.

Особенно, если вы выберете фотографию, на которой есть люди или домашние животные! Чем больше людей или домашних животных на вашей фотографии, тем больше рекомендуемый размер.

Многим нашим клиентам нравятся приятные мелочи, особенно когда речь идет о близких или домашних животных.Вы хотите быть в состоянии распознать их в своем законченном искусстве!

Пожалуйста, смотрите инфографику для очень приблизительного руководства по выбору наилучшего минимального размера в зависимости от количества людей на вашей фотографии.

⬜ У вас твердая рука и вы опытны в других ремеслах.
⬜ Возможно, вам не нравятся крошечные пробелы в готовом изображении.
⬜ Вы опытный художник по алмазам и наслаждаетесь ощущением «щелчка» от квадратных сверл.

⚪ Лучше не возиться с идеальным размещением.
⚪ Вас не смущают крошечные просветы на картинке, едва заметные издалека.
⚪ Вы только что увлеклись этим хобби и хотите увидеть готовую картину как можно быстрее.

1 упаковочная коробка

1 направляющая для листов

1 лоток для сверла

1 x Ручка-аппликатор

2 x Сердечный воск

2 россыпи сыпучих материалов

1 комплект алмазных сверл

В каждом наборе для алмазной живописи есть все необходимое для выполнения задания!

Вы готовы к работе прямо из коробки — никаких дополнительных покупок не требуется.

Первый раз? Мы вас прикрыли.

Руководство содержит цветные инструкции, которые помогут вам в пути. Для получения полного и подробного руководства для начинающих с видео перейдите по ссылке ниже!

Полное руководство для начинающих с видео.

1 упаковочная коробка

1 лоток для сверла

1 x Ручка-аппликатор

2 россыпи сыпучих материалов

2 x Сердечный воск

1 направляющая для листов

1 комплект алмазных сверл

В каждом наборе для алмазной живописи есть все необходимое для выполнения задания!

Вы готовы к работе прямо из коробки — никаких дополнительных покупок не требуется.

Первый раз? Мы вас прикрыли.

Руководство содержит цветные инструкции, которые помогут вам в пути. Для получения полного и подробного руководства для начинающих с видео перейдите по ссылке ниже!

Полное руководство для начинающих с видео.

Если вам нужно, чтобы ваша нестандартная алмазная картина была больше, чем в жизни, чтобы действительно выжать абсолютный максимум деталей (или если у вас просто много места на стене) — у нас есть то, что вам нужно.

Просто нажмите кнопку ниже, чтобы перейти на нашу специальную страницу продукта.

Если у вас есть очень специфические требования к размеру – возможно, вы купили раму заранее или у вас очень мало места в доме, чтобы повесить картину, запросите у нас холст на заказ. Без дополнительной оплаты.

Знаешь размер, который тебе нужен? Нажмите кнопку ниже, чтобы запросить нестандартный размер.

Более яркие цвета, больше блесток

Чем мы занимаемся:

⭐ Осветление теней и темных пятен
⭐ Повышение резкости деталей и повышение яркости цветов

Что мы не можем делать:

⛔ Удалить фон, объекты или людей
⛔ Добавить текст и другие реквизиты

Бесплатные предварительные просмотры при любом заказе

Все, что вам нужно сделать, это спросить!

Нужны дополнительные гарантии перед размещением первого заказа?

Мы знаем, как обидно ждать несколько недель, чтобы наконец получить свой долгожданный пользовательский набор, только чтобы обнаружить, что что-то пошло не так.

Просто отправьте нам сообщение, и мы вышлем вам бесплатный предварительный просмотр графика!

Напишите нам здесь.

Пожизненная гарантия на все комплекты

Мы не гонимся за самой низкой ценой – только за лучшее качество. Попрощайтесь со сломанными сверлами или сверлами неправильного размера, размытыми символами или низкокачественными двойными клейкими полотнами.

Наши экологически чистые сверла являются лучшими в отрасли. В сочетании с импортными японскими принтерами и клеевыми холстами мы обещаем, что вы получите то, за что платите.

Люби это или верни деньги

Heartful Diamonds гордится своей репутацией ведущего поставщика алмазных картин на заказ по всему миру. Тысячи подлинных 5-звездочных отзывов от довольных клиентов — наш знак чести.

Вот почему мы единственная компания, которая обещает вам 100% возврат денег, если вы не удовлетворены тем, как получилось ваше изображение. Делайте покупки с полным спокойствием сегодня!

Если вам нужно, чтобы ваша нестандартная алмазная картина была больше, чем в жизни, чтобы действительно выжать абсолютный максимум деталей (или если у вас просто много места на стене) — у нас есть то, что вам нужно.

Просто нажмите кнопку ниже, чтобы перейти на нашу специальную страницу продукта.

Если у вас есть очень специфические требования к размеру – возможно, вы купили раму заранее или у вас очень мало места в доме, чтобы повесить картину, запросите у нас холст на заказ. Без дополнительной оплаты.

Знаешь размер, который тебе нужен? Нажмите кнопку ниже, чтобы запросить нестандартный размер.

Более яркие цвета, больше блесток

Чем мы занимаемся:

⭐ Осветление теней и темных пятен
⭐ Повышение резкости деталей и повышение яркости цветов

Что мы не можем делать:

⛔ Удалить фон, объекты или людей
⛔ Добавить текст и другие реквизиты

Все, что вам нужно сделать, это спросить!

Нужны дополнительные гарантии перед размещением первого заказа?

Мы знаем, как обидно ждать несколько недель, чтобы наконец получить свой долгожданный пользовательский набор, только чтобы обнаружить, что что-то пошло не так.

Просто отправьте нам сообщение, и мы вышлем вам бесплатный предварительный просмотр графика!

Напишите нам здесь.

Пожизненная гарантия на все комплекты

Мы не гонимся за самой низкой ценой – только за лучшее качество. Попрощайтесь со сломанными сверлами или сверлами неправильного размера, размытыми символами или низкокачественными двойными клейкими полотнами.

Наши экологически чистые сверла являются лучшими в отрасли. В сочетании с импортными японскими принтерами и клеевыми холстами мы обещаем, что вы получите то, за что платите.

Люби это или верни деньги

Heartful Diamonds гордится своей репутацией ведущего поставщика алмазных картин на заказ по всему миру. Тысячи подлинных 5-звездочных отзывов от довольных клиентов — наш знак чести.

Вот почему мы единственная компания, которая обещает вам 100% возврат денег, если вы не удовлетворены тем, как получилось ваше изображение. Делайте покупки с полным спокойствием сегодня!

Heartful Diamonds теперь предлагает ручную диаграмму для всех наших персонализированных бриллиантовых картин на заказ.

Почему это важно? См. сравнительные изображения ниже (откройте их, чтобы увидеть разницу более подробно!)

Конкуренты — без ручного чарта 💻

Тени — самая большая проблема, когда дело доходит до рендеринга нестандартных рисунков с изображением людей, особенно вокруг лиц и кожи.Без вмешательства человека программа просто пытается предсказать наиболее близкое совпадение для каждого пикселя.

Heartful Diamonds — ручная диаграмма ✍️

Наши дизайнеры часами изучают цветовую матрицу, исправляя темные или неравномерные пятна («конфетти») и обеспечивая гораздо более естественный вид. Результат намного более соответствует исходному фото.

Конкуренты — без ручного чарта 💻

Во втором примере тени отбрасывают очень грязный оттенок на лицо малыша.Кроме того, программа перекорректировала розовое платье, сделав его более белым, чем должно быть.

Heartful Diamonds — ручная диаграмма ✍️

Наши дизайнеры выравнивают тени, чтобы сделать ее лицо более ярким и здоровым. Они добавили насыщенности розовому цвету платья, а также сбалансировали тона ее рук. В целом взгляд стал более румяным и упругим!

Для ясности: вам понадобится некоторое время, чтобы вручную создать свой уникальный ромбовидный рисунок

Однако мы больше всего заботимся о качестве, и мы знаем, что вы тоже.Наши опытные дизайнеры должны тщательно проработать каждый символ на холсте, чтобы убедиться, что цвета именно там, где они должны быть.

Самое приятное то, что даже несмотря на все дополнительное время, которое мы тратим на ваши проекты, эта часть процесса всего на 1-2 дня дольше, чем у наших конкурентов. Другие компании будут претендовать на то, чтобы улучшить ваши фотографии, но на этом человеческий вклад заканчивается — все остальное сделано машиной!

После того, как наши дизайнеры закончат работу, он будет передан производителю для изготовления вашего индивидуального комплекта

Файл дизайна безопасно отправляется напрямую нашим производителям и ставится в очередь на печать.Все алмазные сверла упакованы и дважды проверены на качество (и чтобы убедиться, что все на месте!).

и сушится на воздухе. Все собирается и упаковывается в сверхзащищенную упаковку, чтобы убедиться, что ваш потрясающий комплект выдержит путешествие к вам.

Тогда все, что вам нужно сделать, это подождать. Обещаем, оно того стоит!

Ваша картина подходит к холсту?

Перед отправкой заказа мы рекомендуем вам использовать инструмент обрезки «Соотношение сторон», чтобы обеспечить идеальное соответствие вашей фотографии стандартным размерам холста.Это означает, что вы можете выбрать конкретную часть вашего изображения, чтобы превратить ее в алмазную картину (вырезать остальное).

С другой стороны, если ваша картинка уже имеет одно из стандартных соотношений сторон (1:1, 4:3, 16:9), то в этом нет необходимости.

Для неквадратных размеров (4:3, 16:9) доступны горизонтальные и вертикальные параметры обрезки. Вам просто нужно выбрать соответствующий размер, даже если числа перевернуты (3:4, 9:16). Мы выберем ориентацию, которая соответствует размерам вашего изображения.

Напишите нам здесь.

Конфиденциальность и юридическая информация

Все изображения, представленные вами, будут использоваться нами только для разработки и создания вашего индивидуального алмазного искусства. Мы никогда и ни по какой причине не будем передавать или продавать ваши личные фотографии или данные третьим лицам. Heartful Diamonds исходит из того, что все клиенты имеют право использовать любые изображения, представленные нам, для создания своих пользовательских изображений.

Замена цвета

Это просто причудливый термин для описания того, как цвета на вашей индивидуальной алмазной картине могут не совпадать на 100% с вашим цифровым изображением.Цифровые изображения могут иметь миллионы очень тонких цветов — спектр алмазных рисунков ограничен международным стандартом в 447 цветов («DMC»).

Наше программное обеспечение для проектирования заменит определенные оттенки наиболее подходящими цветами. Важно помнить, что чем больший размер вы выберете, тем меньше будет проблем из-за гораздо большей площади для работы.

О нестандартных алмазных картинах

Персонализированное искусство бриллиантов — это больше, чем хобби или времяпрепровождение.Это может быть идеальным способом избавиться от стресса, обрести чувство достижения и создать картину, которая имеет настоящую сентиментальную ценность. Индивидуальная алмазная картина 5D станет отличным подарком для друга или любимого человека. Это также идеальный способ побаловать себя, если вы любите украшать стены своего дома произведениями искусства и фотографиями, которые имеют для вас особое значение.

Индивидуальные алмазные изображения

Наша профессиональная команда художников создаст лучший дизайн из любой выбранной вами картинки.Индивидуальная алмазная роспись изображения, которое имеет для вас особое значение, может сделать алмазное искусство еще более приятным и увлекательным в работе. И в итоге получится то, что вам действительно понравится.

Создайте свой собственный набор для алмазного творчества с полным сверлением (сделай сам)

Прежде чем разместить заказ на индивидуальный набор для алмазной живописи, необходимо знать несколько деталей. Если вы потратите время, чтобы прочитать всю информацию на этой странице, мы гарантируем, что в итоге вы получите нестандартное изображение бриллианта, в которое вы влюбитесь!

{{{ productMediaThumbs }}}

{{{ Название продукта }}}

{{{ productForm }}}

{{{ Описание товара }}}

Присяжные заседают в суде по делу о преступлениях на почве ненависти по делу об убийстве Ахмауда Арбери – The Denver Post

БРУНСВИК, Джорджия.— В понедельник состоялось заседание присяжных по федеральному делу о преступлениях на почве ненависти над тремя белыми мужчинами, осужденными за убийство Ахмада Арбери.

Двенадцать присяжных и четыре заместителя были выбраны из группы из 64 человек, которые были признаны подходящими для работы в качестве беспристрастных присяжных после недели допросов об убийстве чернокожего человека и их отношении к расизму в Америке.

Судья окружного суда США Лиза Годби Вуд заявила в пятницу, что адвокаты должны быть готовы выступить со вступительными заявлениями в понедельник.Она начала с того, что проинструктировала присяжных о характере доказательств и свидетельских показаний при последних приготовлениях к суду.

Уже второй раз в портовом городе Брансуик на побережье Джорджии к югу от Саванны проходит суд по делу об убийстве Арбери, после того как те же трое мужчин были приговорены судом штата к пожизненному заключению за убийство.

Центр заключения округа Глинн через AP, файл

Отец и сын Грег и Трэвис МакМайкл вооружились и погнались за 25-летним Арбери на пикапе после того, как 23 февраля 2020 года заметили его бегущим по их району. Сосед, Уильям «Родди» Брайан, присоединился к преследованию в свой грузовик и записал на мобильный телефон видео, на котором Трэвис Макмайкл стреляет в Арбери из дробовика.

Никаких арестов по делу не производилось, пока два месяца спустя видео не просочилось в сеть.

В прошлом месяце судья приговорил МакМайклов и Брайана к пожизненному заключению за их обвинения в убийстве. Но им все еще предстоит федеральный суд по обвинению в преступлениях на почве ненависти, в которых утверждается, что они нарушили гражданские права Арбери и нацелились на него, потому что он был черным.

Все трое не признали себя виновными в федеральном деле. Судья сказала, что ожидает судебного разбирательства по делу о преступлениях на почве ненависти, которое продлится от семи до 12 дней.

На прошлой неделе судья и адвокаты опросили более 160 потенциальных присяжных из 43 округов южной и восточной Джорджии. Почти две трети были уволены за твердое мнение по делу после просмотра фрагментов государственного судебного процесса по делу об убийстве или новостных сообщений о нем.

Некоторые из 64 присяжных, которым было приказано вернуться в здание суда в понедельник, заявили, что мало что знают об этом деле. Среди них мужчина, идентифицированный в суде только как присяжный заседатель № 1.421, который в пятницу сказал судье: «Единственное, что я действительно знаю, это то, что это громкое дело, и с ним может быть связано видео».

Другим удалось убедить судью, что они могут отложить в сторону то, что им известно, и выслушать федеральный суд исключительно на основании доказательств, представленных в суде. Одна из них, женщина, идентифицированная как присяжный № 422, сказала, что у нее негативные чувства к МакМайклам и Брайану, потому что они, похоже, не проявили раскаяния в государственном суде, но настаивала на том, что она все еще может быть справедливой.

Поиски беспристрастных присяжных в федеральном суде начались всего через неделю после того, как адвокаты объявили, что МакМайклы планируют признать себя виновными по федеральному делу в сделке с прокурорами, которая быстро развалилась. Судья отметил, что только один или два потенциальных присяжных сказали, что знают об этом.

В судебном процессе по делу об убийстве адвокаты защиты утверждали, что подсудимые имели право преследовать Арбери, поскольку подозревали, что он совершал преступления в их районе. Трэвис Макмайкл показал, что открыл огонь в целях самообороны после того, как Арбери напал на него с кулаками и схватился за дробовик.

Объявлена ​​дата премьеры финального сезона «Острых козырьков»

Шестой и последний сезон британской исторической криминальной драмы «Острые козырьки » должен вернуться на BBC 27 февраля.

Дата выхода в США еще не подтверждена; однако Netflix обычно выпускает сезон вскоре после окончания показа BBC. Сезон из шести эпизодов завершится 3 апреля в Великобритании, что предполагает дату выхода в апреле в США, если график будет соответствовать предыдущим годам.

О возвращении шоу было официально объявлено во вторник утром в Бирмингеме, городе, где происходит действие шоу. Большая фреска высотой 42 фута с датой премьеры вместе с картиной Томми Шелби Киллиана Мерфи была открыта в районе Дигбет, напротив паба Old Crown.

Настенная роспись 6-го сезона «Острых козырьков» от уличного художника Akse/Twitter

Мерфи снова сыграет роль лидера преступной группировки Шелби, которая хочет остепениться, судя по недавнему трейлеру.Также возвращаются Пол Андерсон в роли Артура Шелби, Софи Рандл в роли Ады Торн, Гарри Киртон в роли Финна Шелби, Финн Коул в роли Майкла Грея, Аня Тейлор-Джой в роли Джины Грей и Том Харди в роли Альфреда «Алфи» Соломонса.

Хелен МакКрори, сыгравшая тетю Полли, трагически скончалась в апреле прошлого года. Хотя неизвестно, как именно смерть МакКрори повлияет на предстоящий сезон, Мерфи недавно сказал Variety , что «весь сериал действительно посвящен ей и чествует ее».

«Ее присутствие и присутствие ее персонажа очень сильно ощущаются в сериале, и это большая часть пути Томми в этом сезоне», — заявил Мерфи.— Знаешь, без нее все будет по-другому. Это просто будет не то же самое. Я говорил о том, насколько феноменальной она была как актриса и как человек, и это огромная потеря для всего актерского сообщества, а не только для нашего шоу».

Создатель сериала Стивен Найт пишет финальный сезон, а Энтони Бирн возвращается в качестве режиссера. Найт и Бирн также выступают в качестве исполнительных продюсеров вместе с Мерфи, Кэрин Мандабах, Джейми Глейзбрук и Дэвидом Мэйсоном.

Острые козырьки , сезоны 1-5, потоковое вещание, Netflix

Атлас сосудов головного мозга человека показывает различные медиаторы риска болезни Альцгеймера замороженный гиппокамп и ткань верхней лобной коры были получены из Центра клинических исследований старения Stanford/VA/NIA (ACRC) с одобрения местных комитетов по этике и с согласия пациента.Характеристики групп представлены в дополнительной таблице 1. Люди были сгруппированы по клиническому диагнозу, при этом у двух человек с NCI было обнаружено окрашивание β-амилоидных бляшек в гиппокампе, хотя и не в достаточной степени, чтобы опытный патологоанатом мог диагностировать БА по гистопатологическим критериям. Клинический вместо патологического диагноза был выбран из-за потенциального сосудистого вклада в БА, независимого от хорошо известных признаков БА, патофизиологии β-амилоида и тау

), и ядра, собранные на сортировщике клеток SH800S в охлажденные пробирки, содержащие 1  мл NB без ингибитора протеазы. В пилотных запусках мы заметили, что цитометр завышал количество ядер примерно на 3.4 раза, и, таким образом, мы отсортировали около 34 000 ядер, ориентируясь на примерно 10 000 ядер на образец. Отсортированные образцы проверяли на отсутствие мусора на светлопольном микроскопе. Мы отмечаем, что йодиксаноловый градиент ⁵³ может заменить 2,2 М сахарозы, но, к сожалению, при любом градиенте требуется сортировка потока — в отличие от паренхиматозного миелинового дебриса, сосудистый дебрис недостаточно удаляется только центрифугированием в градиенте. Сосудистый мусор будет смешивать следы кДНК ниже по течению с более высоким фоном и низкомолекулярными пиками.

Секвенирование мяРНК на основе капель

Для секвенирования мяРНК на основе капель библиотеки были подготовлены с использованием Chromium Single Cell 3ʹ v3 в соответствии с протоколом производителя (10x Genomics), нацеленным на 10 000 ядер на образец после проточной сортировки (Sony SH800S Cell сортировщик). Для создания кДНК применяли пятнадцать циклов ПЦР перед 16 циклами для окончательного создания библиотеки. Сгенерированные библиотеки snRNA-seq секвенировали на дорожках S4 системы NovaSeq 6000 (150 циклов, Novogene).

Контроль качества snRNA-seq

Количество генов было получено путем сопоставления прочтений с геномом hg38 (refdata-gex-GRCh48-2020-A) с использованием программного обеспечения CellRanger (v.4.0.0) (10-кратная геномика). Для учета несплайсированных ядерных транскриптов подсчитывали риды, сопоставленные с пре-мРНК. Как было опубликовано ранее, пороговое значение 200 уникальных молекулярных идентификаторов (UMI) использовалось для выбора отдельных ядер для дальнейшего анализа ^16,54 . В качестве первоначальной ссылки весь набор данных был спроецирован на двумерное пространство с использованием UMAP для 30 верхних основных компонентов ⁵⁵ . Для строгого контроля качества были объединены три подхода: (1) выбросы с высоким соотношением митохондриальных (более 5%, менее 200 признаков) по отношению к эндогенным РНК и гомотипическим дублетам (более 5000 признаков) были удалены в Seurat ⁵⁶ ; (2) после нормализации и интегрирования scTransform дублеты и мультиплеты были отфильтрованы с помощью DoubletFinder ⁵⁷ ; и (3) после DoubletFinder ядра исследовали вручную с использованием известных маркерных генов, специфичных для типа клеток, при этом ядра, экспрессирующие более одного маркера, специфичного для типа клеток, дополнительно отфильтровывали ^{16,18,57,58,59,60,61} .Например, ядра, содержащие любые чтения для следующих маркеров типов клеток, были впоследствии отфильтрованы: MOBP , MBP , MBP , MOG , SLC38A11 , PDGFRB , PDGFRB , GFAP , SLC1A2 AQP4 . Мы отмечаем, что сосудистые ядра в предыдущих наборах данных одиночных клеток человека демонстрируют загрязнение другими генными маркерами, специфичными для типа клеток, что потенциально затрудняет последующий анализ. После применения этих шагов фильтрации набор данных содержал 143 793 высококачественных одиночных ядра.

Аннотации клеток и дифференциальный анализ экспрессии генов

Функция интеграции Сера использовалась для приведения данных в соответствие с настройками по умолчанию. Гены были спроецированы в пространство основных компонентов (PC) с использованием анализа основных компонентов (RunPCA). Первые 30 измерений использовались в качестве входных данных для функций Seurat FindNeighbors, FindClusters (с разрешением 0,2) и RunUMAP. Вкратце, граф общих ближайших соседей был построен на основе евклидовой метрики расстояния в пространстве ПК, а ячейки были сгруппированы с использованием метода Лувена.Функции RunUMAP с настройками по умолчанию использовались для расчета двумерных координат UMAP и поиска отдельных клеточных популяций. Положительную дифференциальную экспрессию каждого кластера по отношению ко всем другим кластерам (модельный анализ транскриптомики одиночных клеток; MAST) использовали для идентификации маркерных генов для каждого кластера ⁶² . Мы аннотировали типы клеток, используя ранее опубликованные маркерные гены ^16,19,61,63 . Для BEC оценки специфичности зонирования для каждого гена рассчитывались отдельно для артериальных, капиллярных и венозных сегментов, как в следующем примере для данного гена в капиллярах:

$${\rm{Capillary}}\,{\rm{специфичность }}\,{\rm{счет}}={\rm{Среднее}}\left[\log \left(\frac{{\rm{Капилляр}}\,{\rm{logCPM}}}{{\ rm {артериальный}} \, {\ rm {logCPM}}} \ справа), \, \ mathrm {log} \ слева (\ frac {{\ rm {капиллярный}} \, {\ rm {logCPM}}} { {\rm{Veinous}}\,{\rm{logCPM}}}\right)\right].$$

Дифференциальная экспрессия генов, сравнивающая образцы AD, ApoE4 и NCI или сравнивающие маркеры субкластеров типов клеток, была выполнена с использованием алгоритма MAST ⁶² , который реализует двухкомпонентную барьерную модель. Натуральный логарифм Сеурата (кратное изменение) > 0,5 (абсолютное значение), скорректированное значение P (поправка Бонферрони) < 0,01 и экспрессия более чем в 10% клеток в обеих группах сравнения требовались для рассмотрения гена, дифференциально экспрессируемого для субкластерного анализа и натуральный логарифм (кратное изменение) > 0.3 (абсолютное значение), скорректированное значение P (поправка Бонферрони) < 0,01 и экспрессия более чем в 10% клеток в обеих группах сравнения для сравнения AD и ApoE4, оба более строгие, чем настройки Сера по умолчанию. Мы включили возраст, пол и группу в качестве ковариатов в нашу модель. Для области мозга (т. Анализы обогащения биологических путей и генной онтологии проводились с использованием Enrichr ⁶⁴ или Metascape ⁶⁵ с входными видами, установленными на Homo sapiens ⁶⁵ .Графики UpSet были созданы с использованием идентифицированных DEG в качестве входных данных с использованием пакета R UpSetR ⁶⁶ . Диаграммы были созданы с помощью BioRender.

Монокль для анализа траектории

Монокль использовался для создания псевдовременного анализа траектории в эндотелиальных и пристеночных клетках головного мозга ²⁴ . Клетки группировали в Seurat, и кластерные маркеры использовали в качестве входных данных в Monocle, чтобы сделать вывод об артериовенозных отношениях внутри эндотелиальных клеток и перицитов. В частности, вложения UMAP и подкластеры ячеек, сгенерированные из Seurat, были преобразованы в объект cell_data_set с использованием SeuratWrappers (v.0.2.0), а затем используется в качестве входных данных для изучения графика траектории и измерения псевдовремени с помощью анализа независимых компонентов (ICA) с помощью Monocle. Кластерные маркерные гены, идентифицированные в Seurat, использовались для создания псевдовременного маршрута и наносились на график с использованием функции «plot_pseudotime_heatmap». Для пристеночных клеток вариабельные гены были ограничены генами с log[средней экспрессией] > 1 (Seurat) для еще более надежного упорядочения клеток.

Связь между клетками

Взаимодействия между клетками, основанные на экспрессии известных пар лиганд-рецептор в различных типах клеток, были выведены с использованием CellChatDB ⁶⁷ (v.0,02). Короче говоря, мы следовали официальному рабочему процессу и загрузили нормализованные счетчики в CellChat и применили функции предварительной обработки «identifyOverExpressedGenes», «identifyOverExpressedInteractions» и «projectData» со стандартными наборами параметров. В качестве базы данных мы выбрали пути «секретной передачи сигналов» и использовали предварительно скомпилированные человеческие «белковые взаимодействия» в качестве априорной сетевой информации. Для основного анализа были применены основные функции «computeCommunProb», «computeCommunProbPathway» и «aggregateNet» с использованием стандартных параметров и фиксированных начальных значений рандомизации.Наконец, для определения отправителей и получателей в сети функция «netAnalysis_signalingRole» была применена к слоту данных «netP».

Мыши

Старые самцы мышей C57BL/6 (возраст 19 месяцев) были получены из колонии грызунов Национального института старения. Молодых самцов мышей C57BL/6 (возраст 3 месяца) получали из The Jackson Laboratory или Charles River Laboratories. Самцов мышей Thy1-hAPP ^Lon,Swe и однопометных мышей дикого типа ³⁷ выращивали до возраста 12–14 месяцев.Всех мышей содержали на 12-часовом цикле свет-темнота и обеспечивали свободный доступ к пище и воде. Весь уход за животными и процедуры соответствовали Закону о защите животных, а также институциональным правилам и были одобрены V.A. Комитет Пало-Альто по исследованиям на животных и институциональная административная комиссия по уходу за лабораторными животными в Стэнфордском университете.

Секвенирование отдельных клеток и ядер мышей дикого типа и APP T41B BEC

Выделение целых клеток из центральной нервной системы с использованием ранее описанных методов ^68,69,70 .Вкратце, кору и гиппокамп подвергали микродиссекции, измельчению и перевариванию с использованием набора для нейронной диссоциации (Miltenyi). Суспензии фильтровали через сито с отверстиями 100 мкм и удаляли миелин центрифугированием в 0,9 М сахарозе. Оставшуюся миелин-истощенную клеточную суспензию блокировали в течение 10 минут преблоком Fc (CD16/CD32, BD 553141) на льду и окрашивали в течение 20 минут антителами для различения BEC (CD31 ⁺ /CD45 ^— ). BEC от 12-14-месячных мышей Thy1-hAPP ^{Lon, Swe} и однопометных мышей дикого типа контроля ³⁷ (пул из 4-6 мышей в группе) сортировали в PBS с 0.1% БСА. Выделение ядер из гиппокампа мыши в возрасте 4–6 месяцев проводилось по протоколам, адаптированным из предыдущих исследований ^{16,17,53,61,71} . Вкратце, ткань гомогенизировали с помощью стеклянного пуансона в 2 мл охлажденного льдом буфера EZ PREP (Sigma, N3408) и инкубировали на льду в течение 5 минут. Центрифугированные ядра ресуспендировали в 1% BSA в PBS с 0,2 ед. мкл ингибитора РНКазы ^-1 и фильтровали через 40-мкм клеточный фильтр. Клетки или ядра немедленно подсчитывали с помощью гемоцитометра Нойбауэра и загружали в прибор для одноклеточных хромированных клеток (10x Genomics) для получения гелевых шариков из одиночных клеток в эмульсиях (GEM).Библиотеки 10x Genomics v3 были подготовлены в соответствии с инструкциями производителя. Библиотеки секвенировали на Illumina NextSeq 550 (парный конец; чтение 1: 28 циклов; индекс i7: 8 циклов, индекс i5: 0 циклов; чтение 2: 91 цикл). Демультиплексирование выполняли с помощью набора инструментов Cellranger (v.3.0.0) команды «cellranger mkfastq» и команды «cellranger count» для выравнивания с транскриптомом мыши, разделения штрих-кодов клеток, свертывания UMI в транскрипты и количественной оценки на уровне генов. Было достигнуто около 70% насыщения секвенирования (более 20 000 прочтений на клетку), в среднем около 2000 генов, обнаруженных на клетку, и около 16 500 генов, обнаруженных в целом.Нисходящий анализ с использованием пакета Seurat (v.3) ⁷² выполняли, как описано ранее ¹² , с применением стандартных алгоритмов фильтрации клеток, выбора признаков и уменьшения размерности. Образцы с числом уникальных признаков менее 1000 и более 4000, образцы с более чем 15 % митохондриальной РНК, образцы с более чем 15 % малых субъединичных рибосомных генов (Rps) и числом более 10 000 были исключены из анализа. Гены были проецированы в пространство ПК с помощью анализа главных компонентов (RunPCA).Первые 30 измерений использовались в качестве входных данных для функций Seurat FindNeighbors и RunTsne. Вкратце, граф общих ближайших соседей был построен на основе евклидовой метрики расстояния в пространстве ПК, а ячейки были сгруппированы с использованием метода Лувена. Функции RunTsne с настройками по умолчанию использовались для расчета двумерных координат t -распределенного стохастического встраивания соседей ( t -SNE) и поиска различных клеточных популяций. Затем клетки и кластеры визуализировали с использованием трехмерного встраивания t -SNE на той же метрике расстояния.Дифференциальный анализ экспрессии генов проводили с применением MAST. Значимые DEG в Thy1-hAPP ^{Lon, Swe} BEC были вызваны log (кратность изменения)  > 0,15 (абсолютное значение), скорректированное значение P (поправка Бонферрони)  < 0,01. Этот заниженный логарифм (кратное изменение) должен был гарантировать, что наши утверждения об ограниченном совпадении с AD BEC человека были надежными.

Анализ GWAS

Для расчета пропорциональной экспрессии генов, специфичных для типа клеток, мы следовали методу EWCE, описанному в предыдущем исследовании ⁴² и ранее применявшемуся к данным snRNA-seq человека ¹⁷ .Для анализа AD мы составили список генов с наибольшим риском GWAS из исх. ³⁹ , исх. ⁴⁰ и арт. ⁴¹ , отсортировано по убыванию приблизительного значения P . Сумма экспрессии каждого гена равна 1 по типам клеток, при этом каждая ячейка тепловой карты показывает долю общей экспрессии генов, определенную с помощью анализа EWCE. Набор генов 720 AD и признаков GWAS, связанных с AD, был получен из ref. ¹⁷ , и с помощью анализа EWCE для каждого гена определяли наиболее сильно экспрессирующий тип клеток.Исходный список был немного проанализирован до 720, так как несколько генов не были обнаружены в нашем наборе данных.

Иммуногистохимия

Свежезамороженная ткань головного мозга людей с NCI и людей с БА (гиппокамп и верхняя лобная кора, примыкающая к ткани, обработанной для секвенирования мяРНК, а также мозговые оболочки) подвергали иммуногистохимии (ИГХ). Десятимикрометровые срезы, помещенные на предметные стекла SuperFrost Plus, фиксировали 4% параформальдегидом (Electron Microscopy Services, 15714S), разведенным в PBS при 4 °C в течение 15 минут перед обезвоживанием с помощью серии этанола или воздушной сушки.Срезы блокировали в TBS++ (TBS +  3% ослиной сыворотки (130787, Jackson ImmunoResearch) + 0,25% Triton X-100 (T8787, Sigma-Aldrich)) в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Срезы инкубировали с первичными антителами при 4 °C в течение ночи: козьи поликлональные антитела против коллагена IV типа (1:200, AB769, Sigma), кроличьи поликлональные антитела против CYP1B1 (1:100, HPA026863, Atlas Antibodies), кроличьи поликлональные антитела против SLC4A4. (1:100, HPA035628, антитела Atlas), кроличьи поликлональные антитела к SLC47A1 (1:100, HPA021987, антитела Atlas), кроличьи поликлональные антитела к ABCA8 (1:100, HPA044914, антитела Atlas), мышиные моноклональные антитела к CD31 (1 :100, JC70A, Dako), кроличьи поликлональные антитела к VWF (1:100, GA527, Dako), кроличьи поликлональные антитела к SLC39A10 (1:100, HPA066087, Atlas Antibodies), кроличьи поликлональные антитела к ALPL (1:100, HPA007105 , Atlas Antibodies), кроличьи поликлональные анти-A2M (1:100, HPA002265, Atlas Antibodies), кроличьи моноклональные анти-β-амилоиды (1:500, клон D54D2 XP, CST) и мышиные моноклональные анти-актин, α-гладкие мышцы – Cy3 (1:100, клон 1A4, Sigma).Перед визуализацией срезы промывали, окрашивали вторичными антителами, конъюгированными с Alexa Fluor (1:250), и Hoechst 33342 (1:2000, h4570, Thermo Fisher Scientific), помещали и закрывали покровным стеклом ProLong Gold (Life Technologies) или VECTASHIELD (Vector Laboratories). на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе (Zeiss LSM880). Связанную с возрастом аутофлуоресценцию гасили перед монтажом с помощью Судан Блэк Б, как и прежде ^8,70 . Программное обеспечение ImageJ Национального института здравоохранения использовалось для количественного определения количества ядер Hoechst ⁺ на изображении, процентной доли сосудистой сети (коллаген IV), количества ядер Hoechst ⁺ в сосудистой сети коллагена IV ⁺ или прогнозируемого DEG. SLC39A10 среди CD31 ⁺ сосудистой системы, следуя ранее описанным протоколам ^8,15,73 .Короче говоря, на каждого пациента окрашивалось не менее пяти изображений, а визуализация и анализ выполнялись слепым наблюдателем.

Статистические данные и воспроизводимость

Эксперименты по проверке иммуноокрашивания были независимо повторены по крайней мере дважды с аналогичными результатами. Как указано в подписях к рисункам, некоторые изображения иммунного окрашивания взяты из Атласа белков человека ^25,74 и доступны на https://www.proteinatlas.org/.

Сводка отчета

Дополнительная информация о дизайне исследования доступна в Резюме отчета об исследовании природы, связанном с этим документом.

Бывший сотрудник Angels, обвиняемый по делу Skaggs, не дает показаний смерть питчера Тайлера Скэггса.

Краткое и беспрецедентное представление защиты пришло на следующий день после того, как федеральные обвинители завершили свое дело показаниями четырех игроков высшей лиги, которые признали употребление наркотиков в прошлом, заявив, что получили таблетки оксикодона от подсудимого Эрика Кея.

Кей, которая сталкивается с обвинениями в распространении наркотиков и заговоре, получила таблетки оксикодона для игроков и, согласно показаниям, употребляла их. Питчер Блейк Паркер, последний из шести свидетелей, вызванных защитой, показал, что он получил опиоиды от Кей в 2018 году, в последний год, когда Паркер играл за «Ангелов».

Заключительные прения запланированы на четверг, восьмой день суда над Кей в центре Форт-Уэрта. Федеральный суд находится примерно в 15 милях от того места, где «Ангелы» должны были играть против «Техасских рейнджеров», когда 1 июля 2019 года Скэггс был найден мертвым в своем гостиничном номере в пригороде Далласа.Ему было 27 лет.

В отчете коронера говорится, что Скэггс задохнулся от рвоты, а в его организме была токсичная смесь алкоголя, фентанила и оксикодона.

Прокуратура утверждала, что Кей был единственным, кто мог предоставить наркотики, которые привели к смерти Скэггса, и что наркотики были доставлены после прибытия команды в Техас. Эксперт свидетельствовал правительству, что Скаггс умер из-за фентанила, который значительно сильнее оксикодона.

Защита возражала, что у Скэггса было несколько поставщиков, что Кей не давала ему наркотики после того, как команда прибыла в Техас, и что нет никакого способа доказать, что фентанил стал причиной смерти.

Кей грозит минимум 20 лет тюремного заключения и максимум пожизненный срок по обвинению в распространении, повлекшем смерть. Подсчет заговора длится максимум 20 лет.

Паркер был взволнован, когда впервые выступил, сказав, что считает Скэггса другом, и ответил: «Я так и думал», когда его спросили, хороший ли Кей парень. Паркер сказал, что перестал просить у Кей таблетки, когда Кей сказал, что пытался бросить с помощью оксикодона.

Кей работал связным с общественностью команды во многих поездках, и поездка в Техас была его первой после возвращения из реабилитационного центра.Кей был отправлен в отпуск вскоре после смерти Скаггса и больше не вернулся в команду.

Еще два бывших игрока «Энджелс», инфилдер Андрелтон Симмонс и питчер Тревор Кэхилл, показали, что видели Скаггса в отеле за ночь до того, как его нашли мертвым. Оба сказали, что Скэггс упомянул о возможности уйти, но они не думали, что он покинул отель.

Защита спросила Гарета Рамоса, сводного брата Скаггса, удалял ли он какие-либо сообщения с телефона Скаггса, когда он был передан ему полицией в пригороде Саутлейка, где Скаггс умер.