Интерьер для: Гайд по стилям: выбираем интерьер для городской квартиры :: Дизайн :: РБК Недвижимость

Гайд по стилям: выбираем интерьер для городской квартиры :: Дизайн :: РБК Недвижимость

Рассказываем о самых популярных стилях оформления квартир и о том, как создать интерьер самостоятельно

Фото: Christian Hillebrand/shutterstock

Стиль интерьера квартиры определяет концепцию всего ремонта: выбор напольного покрытия, отделочных материалов, мебели, декора. Можно попробовать повторить модный интерьер с картинки или придумать свой. Но стоит понимать, что любительские эксперименты без определенных знаний могут сделать жилье безвкусным и загроможденным. Если вы приняли решение создать интерьер своими силами, рекомендуем придерживаться какого-то одного стиля.

Рассказываем о наиболее популярных стилях дизайна интерьеров и о том, как их воплотить в небольшой городской квартире.

Функциональный минимализм

Для минимализма характерны простота, практичность и сдержанность в оформлении. Основная концепция дизайна — много свободного пространства и как можно меньше предметов. Удачным вариантом для квартиры в таком стиле станет выбор функциональной мебели простых геометрических форм. Еще одно преимущество — отказ от встроенных ящиков, подлокотников и других отвлекающих деталей. В качестве декора можно подобрать картины, а для окон лучше использовать жалюзи или легкие занавески.

Цветовая гамма обычно монохромна — это сочетание двух базовых цветов и минимальное количество ярких акцентов. В отделке лучше всего использовать натуральные материалы: дерево, природный камень, кирпич. При оформлении интерьера квартиры в стиле минимализм стоит отказаться от орнаментов, узоров, барельефов и других сложных конструкций на потолке и полу. Этот стиль хорошо подойдет для малогабаритного жилья: он визуально увеличивает пространство и позволяет рационально использовать жилплощадь.

Скандинавский стиль

Жители стран Северной Европы привыкли к суровому климату и долгим зимам, а придать дому уют и тепло им помогает большое количество пастельных оттенков и натуральных материалов. В качестве основного цвета интерьера используют белый: он объединяет все зоны и наполняет помещения светом, отражая солнечные лучи. Окна лучше оставить без текстиля или сделать выбор в пользу полупрозрачных тканей: это может быть хлопок или лен. Дополнить интерьер можно ковриками, абажурами, декоративными подушками ярких цветов, торшерами, настенными бра, различными светильниками и лампами.

В стиле преобладает практичная мебель с лаконичным дизайном (Фото: Photographee.

eu/shutterstock)

Как и в минимализме, в скандинавском стиле преимущественно используют практичную мебель с лаконичным дизайном, чаще всего из светлых пород дерева. В качестве декора хорошо смотрятся цветочные композиции в стеклянных вазах, зеркала, свечи, керамику, картины морской тематики. Также стоит обратить внимание на текстиль: ткани часто имеют несложные цветочные узоры и абстрактные орнаменты. Отличительные детали стиля — небольшой современный камин и стол из цельной древесины, лосиные рога, меховой ковер или коряга со столешницей вместо журнального столика.

Эстетика лофта

Лофт-апартаменты сегодня пользуются популярностью среди преуспевающих молодых бизнесменов, некоторые пространства сдаются в аренду под офисы и для проведения вечеринок. Основными особенностями этого стиля являются высокие потолки, огромные окна, кирпичные стены, открытые трубы и системы вентиляции.

Повторить лофтовый интерьер можно и в обычной городской квартире, соблюдая основные условия: помещение должно максимально напоминать промышленное или складское пространство. В интерьере обычно присутствуют бетонные стены, грубая штукатурка, необработанное дерево, кирпичная кладка или их имитация. Чтобы еще больше приблизиться к стилю лофт, можно оставить открытыми радиаторы отопления, трубы, проводку и другие коммуникации. Из мебели отлично впишется барная стойка, высокие стулья, декоративные цветные бочки и двусторонние стеллажи.

Хай-тек

Стиль хай-тек отличается функциональностью и удобством. Для отделки используют, как правило, металл, пластик и стекло. В таком интерьере преобладают белый, черный и серый цвета. При выборе техники особое внимание уделяется ее дизайну. Стильные инновационные устройства являются ключевыми атрибутами этого направления и занимают центральное место в интерьерах.

Этот стиль предполагает практически полное отсутствие декора (Фото: Alexander Steam/shutterstock)

Еще одной важной особенностью этого стиля является обилие отражающих поверхностей и осветительных приборов. Это могут быть комбинации точечных светильников и потолочные люстры футуристических форм. Для спальни можно использовать кровать со встроенной подсветкой. Удачным решением для интерьера квартиры в стиле хай-тек станет выдвижная мебель, безрамочные зеркала и стеклянные перегородки. Этот высокотехнологичный стиль предполагает практически полное отсутствие декора: можно добавить несколько черно-белых снимков, абстрактных картин или комнатных растений в модных металлических горшках.

Экологичный интерьер

Для тех, кто устал от городской суеты, подойдут природные цвета и фактуры в сочетании с живыми растениями. Для создания экологичного интерьера используют только природные материалы: глину, бамбук, дерево, камень. Самостоятельно можно сделать стильные горшки из винных пробок или стеллаж из строительных лесов. Впишутся в такой интерьер и небольшие красивые камни, привезенные из отпуска с моря.

Еще больше приблизиться к природе поможет мебель из цельного дерева, плетеные кресла из ротанга и льняные шторы.

При этом интерьер в экостиле не должен быть перегружен. Достаточно нескольких акцентных элементов и тематической отделки. В ванной комнате можно установить раковину из оникса и повесить бамбуковые полотенца. Кухню украсят связки сухих трав и деревянные солонки. В гостиной можно сделать вертикальное озеленение, но стоит учитывать, что такой декор требует постоянного ухода.

Автор

Елена Коннова

Интерьер для жизни

Эта московская квартира по проекту архитекторов из «КВ–бюро»—пример универсального интерьера для мегаполиса

Юлия Вишнепольская:
«Идея заключалась в том, чтобы создать правильное городское пространство для семейной пары. Подобный формат вполне оправдан. Это как раз тот случай, когда дети выросли и живут отдельно, а родителям, как говорится, хочется пожить для себя. Спокойный, ровный интерьер, без пафоса и экстравагантности. Заказчики на всём протяжении проектирования давали понять, в каком направлении нам двигаться, рассказывали, что им нравится, что по душе. В итоге получилась такая приятная, аккуратная квартира для жизни»

Рассказывает Юлия Вишнепольская: «Квартира находится в одном из современных жилых комплексов. Ключевым пожеланием владельцев была просторная общественная зона. Объединив гостиную, кухню и столовую в одно помещение и расположив его вдоль длинного витражного фронта, мы получили наполненный светом объём для повседневной жизни. Чтобы его организовать, пришлось провести серьёзную перепланировку. Поскольку принципиальным моментом было наличие единого пространства для активной жизни, то хозяева с лёгкостью согласились на то, чтобы спальня получилась небольшой.

Для сна вполне достаточно такой скромной площади, поскольку основное время заказчики проводят именно в гостиной. Собственно, вся их жизнь крутится вокруг неё. Владельцы—семейная пара. Это довольно молодые, но уже состоявшиеся, знающие, чего хотят, люди. Занимаются бизнесом, часто принимают гостей и вообще ведут активный образ жизни. Они не любят слишком навороченные интерьеры, где много всего напоказ. Заказчикам хотелось чего-то более ровного, без оглядки на модные тенденции. Поэтому мы выбрали нейтральный стиль, качественную, но не растиражированную мебель, мягкие, уравновешенные цвета. Как нам кажется, такой интерьер—оптимальный вариант городского жилья для активных, успешных людей. В нём есть всё для комфортной жизни: большая светлая гостиная, постирочная, приватный блок с ванной комнатой и вместительной гардеробной. Интерьер при этом ненавязчивый, аккуратный, функциональный, располагает к отдыху и времяпрепровождению в кругу семьи и друзей».

Как создать интересный и уникальный интерьер для квартиры?

Вряд ли кто-то будет спорить с тем фактом, что абсолютно каждый человек хочет жить. Красивой и стильной квартире. Только вот далеко не все люди готовы тратить деньги за услуги дизайнера. К счастью. Во многих случаях это и не нужно, ведь при желании человек вполне может самостоятельно создать стильный интерьер для своей квартиры. Только вот как это сделать? Давайте попытаемся найти ответ на этот вопрос!

Итак, для начала вам необходимо определиться с тем, в каком стиле должен быть оформлена ваша квартира. В наше время существует довольно большое количество стилей интерьера. И у каждого стиля имеются свои особенности. Постарайтесь выбрать именно тот стиль, который лучше всего подходит для вас. Вообще, стоит отметить тот факт, что многие дизайнеры сочетают в своих работах несколько стилей. Только вот они знают, что делают. Если вы не являетесь профессиональным дизайнером, то вам лучше остановиться на каком-нибудь одном стиле.

Поищите в интернете примеры оформления комнаты в приглянувшемся вам стиле. Вообще, интернет очень помогает при создании уникального дизайна. Существуют сайты, на которых вы вполне можете посмотреть свежие идеи для вашего интерьера! И некоторые из этих идей вы вполне можете реализовать самостоятельно. Помните, что вам не стоит копировать те примеры интерьеров, которые вы сможете найти в интернете. Лучше использовать их в качестве ориентиров, создавая собственный уникальный и неповторимый интерьер!

Определитесь с цветовой гаммой, в которой будет оформлен интерьер вашей квартиры. Вообще, лучше выбрать несколько цветов, которые хорошо сочетаются между собой, и использовать их в создании интерьера. При этом лучше отдать предпочтение более спокойным цветам. Вполне возможно, что слишком яркие и насыщенные цвета будут утомлять вас.

Вообще, одним из наиболее важных элементов любого интерьера является мебель. И к выбору мебели вам стоит подойти с максимальной ответственностью. Естественно, что по стилю мебель должна подходить к интерьеру вашей квартиры. Кроме того, мебель должна подходить к интерьеру вашей квартиры и по цветовой гамме. Также обязательно убедитесь в том, что выбранная вами мебель хорошо сочетается между собой. Если вы не уверены в том, что сможете выбрать мебель, которая будет хорошо сочетаться между собой, то вы вполне можете приобрести мебельный набор. Как правило, подобные наборы создаются дизайнерами. Поэтому вы можете быть полностью уверенными в том, что мебель. Которая входит в набор, отлично сочетается между собой.

двухкомнатная квартира в Красногорске — INMYROOM

Место

красногорск

Фото

ольга шангина

Вкратце

Дизайнер создала удобную планировку с просторной кухней-гостиной, изолированной спальней, двумя санузлами и встроенными системами хранения. В оформлении сделали ставку на микс классики с современным стилем — получилось комфортно, уютно и жизнерадостно.

Подробности

Заказчики — взрослая семейная пара, их дети уже выросли, поэтому они живут для себя, много путешествуют. И интерьер новой квартиры должен был быть соответствующим — удобным, комфортным, уютным.  

Была необходима вместительная кухня с большим отдельно стоящим холодильником — в итоге поставили два, угловой диван в гостиной и места для книг, так как заказчица много читает. Еще одно пожелание — отдельная спальня с большой кроватью, отдельный гардероб, обязательно два санузла: в одном — душевая, в другом — ванна с гидромассажем.

Дизайнер Лина Савина предложила сочетать в обстановке классические элементы с современной мебелью — заказчики эту идею поддержали. Также они были за смелые сочетания цветов. 

Стены в гостиной покрасили, это было важно, чтобы подобрать более подходящий оттенок. В спальне использовали декоративную штукатурку — она сделала поверхности более сложными и многогранными, в прихожей — обои для придания уюта. В ванных комнатах сочетали керамогранит и штукатурку. На полу — инженерная доска. 

«Так как спальня по размеру получилась небольшой из-за расположения воздуховодов, мы решили вынести системы хранения в отдельное помещение. Также есть вместительные шкафы в прихожей, ванной комнате, а в туалете в глубоких шкафах расположены стиральная машина, гладильная доска и складная сушилка», — рассказывает дизайнер.

Цветовая палитра гостиной построена вокруг сиреневого дивана — заказчица не смогла перед ним устоять в магазине. Спальня довольно спокойная: кремовых, молочных оттенков. А вот ванные комнаты очень сочные и динамичные, что дает «вау-эффект» при попадании из нейтральных помещений в яркие.

«Картина в спальне над кроватью имеет свое значение: заказчики очень много переезжали за свою жизнь, и я предложила им назвать проект „Перелетные птицы“. В проекте были еще изображения птиц, но они не прижились. Эту картину нам написала художница из Сочи — Мария Майорова, это батик на шелке», — рассказывает Лина Савина.

Планировка

Обмерный план

План с расстановкой мебели

Бренды, представленные в проекте

Холл
Отделка: обои, Borastapeter
Освещение: Citilux; Arte Lamp

Кухня-гостиная
Отделка: краска, Little Greene
Мебель: диван и столик, Mobel Zeit
Ковер: Zara Home
Текстиль: шторы и подушки, A&D HOME
Декор: Zara Home; H&M Home
Освещение: Lightstar; Arte Lamp; Lucide

Спальня
Мебель: кровать и тумбы, Mobel Zeit
Декор: картина на заказ, Мария Майорова
Освещение: Sylcom

Кухня
Отделка: фартук, Kerama Marazzi
Мебель: стол, ИКЕА
Смесители: Grohe
Освещение: Lightstar; Arte Lamp

Ванная комната
Отделка: Kerama Marazzi; декоративная штукатурка, Аffresco
Напольное покрытие: Kerama Marazzi
Декор: «Инлавка»
Санфаянс: Roca; Vitra
Смесители: BelBagno
Освещение: Lightstar; Arte Lamp; De Markt

Хотите, чтобы ваш проект был опубликован на INMYROOM? Присылайте фотографии интерьера на  wow@inmyroom. ru

Интерьер для семейного комфорта. Особенности проектов для семей с детьми.

Сложно разработать стильный дизайн-проект. Еще сложнее адаптировать его под реальные потребности конкретной семьи. Студия «Интерьерком» создает только жизнеспособные проекты, которые позволяют чувствовать себя комфортно каждый день. Именно поэтому среди наших клиентов много семейных пар с детьми.

Продуманность, эргономика, практичность, грамотное зонирование пространства – вот, что ценит эта категория заказчиков. Делимся секретами: что же является самым важным при разработке семейных интерьеров.
 

Интерьер для всех – интерьер для каждого!

 

Самое сложное в работе – учесть интересы всех членов семьи, чтобы каждый, приходя домой, чувствовал себя здесь в своей тарелке. Всем должно быть хорошо и комфортно. Это сложно, но возможно. Главное – понять общее настроение и атмосферу семьи, найти то, что объединяет этих людей. От общего к частному. У каждого члена семьи есть собственное я, свои вкусы и предпочтения. Поэтому так важно, разрабатывая дизайн-проект для квартиры или коттеджа, создать персональный уголок, как для самых маленьких, так и для старших.

Очень просто работать, когда площадь достаточно большая и у каждого члена семьи есть своя персональная комната:

• Для каждого ребенка отдельная детская;
• Для родителей – спальня;
• Кабинет для работы;
• Комната для гостей;
• Два санузла.

А кроме этого общая гостиная, просторная кухня и достаточное количество подсобных помещений – кладовая, гардеробная, хозяйственная комната. Но это идеальные условия.

Чаще приходится иметь дело со стандартными помещениями, где два ребенка будут делить одну комнату, у родителей есть небольшая спальная комната, объединяющая в себе функции кабинета и гардеробной, а гостиную приходится совмещать с кухней. Здесь успех зависит от правильно расставленных акцентов и грамотного зонирования.

Подробнее в статье: Зонирование комнат. Правила и способы.

Планировка, в зависимости от состава семьи:

 

• Интерьер для небольшой семьи:

Мама, папа и ребенок – стандартная семья. Втроем можно вполне комфортно разместиться в небольшой квартире. Идеальным вариантом может быть даже евродвушка современной планировки. В этом случае гостиная и кухня – объединяются в одно помещение, родителям выделяется спальня, а малышу – детская.

• Интерьер для большой семьи:

В семье, где двое и больше детей, вопрос с распределением комнат стоит очень остро. Достаточно сложно выделить для каждого из них отдельную детскую, поэтому одно пространство необходимо приспособить для комфортного обитания сразу нескольких человек.

Проще всего разрабатывать интерьер детской для двойняшек или близнецов. Также комфортно соседствуют вместе погодки или дети с небольшой разницей в возрасте. Сложнее, когда комнату вынуждены делить дети разного пола или подросток с малышом. Но даже в этом случае грамотное зонирование и современная мебель позволяют справиться с задачей.

Все наши проекты детских комнат смотрите в данном разделе.

Дефицитные квадратные метры в детской:

 

Любая детская комната – это самодостаточное пространство для жизни. В ней обязательно должно найтись место для:

• Кровати или спального места;
• Рабочего места – стола или уголка;
• Зоны хранения – для одежды, игрушек, книг, личных вещей, постельного белья и прочее;
• Зоны отдыха и игр;
• Зоны активного отдыха – по возможности.

Если детскую будут делить два ребенка, то игровая зона и зоны отдыха могут быть совместные, а вот спальные места, рабочие и зоны хранения для каждого свои.

Если места для размещения всего необходимого не хватает, можно мыслить не по горизонтали, а по вертикали. Самый простой пример – двухъярусные кровати. Более современные решения – кровати-чердаки или чердачные конструкции. Разместить спальные места под потолком или убрать туда игровую зону – отличное решение для комнат с высокими потолками.

Читайте также: Двухъярусная кровать в интерьере детской. Фото.

Практичные решения для детских комнат:

 

Современный стиль и стиль лофт – самые практичные для оформления детской. Здесь используются простые, надежные, натуральные и очень практичные материалы. Эффектная кирпичная стена – это еще и отличное антивандальное решение. Графитовое покрытие для рисования мелом также отлично впишется в эти стили.

Спортивный уголок – это возможность выплескивать накопившуюся энергию в специально созданном для этого месте, не ломая и не портя мебель.

Комбинирование разных обоев, использование акцентных пятен, фотообоев, элементов декора – это отличная возможность производить частичный ремонт или замену покрытия по необходимости, не затевая глобальное обновление интерьера.

Простые цвета в качестве основы, базовые оттенки на стенах и в мебели – также вариант для детской. Внести «живость» и «раскрасить» интерьер позволят текстиль и предметы декора. В любой момент, когда обстановка надоест или ребенок подрастет и захочет изменить свою комнату, сделать это можно будет просто с помощью смены декораций!

Еще статьи по теме: Комната подростка. Дизайн.

Студия Интерьерком берется за любые, даже самые сложные проекты! Звоните!

московский интерьер для коллекционера • Интерьер+Дизайн

Гостиная. На стене диптих «Персона» Алексея Ланцева. На камине фигура «Челобрек» Федора Петрика. На столике скульптура «Зарема. Балерина Каминская», авт. Е. А. Янсон-Манизер. Картины были подобраны заказчиком в галерее pARTnerproject gallery.

Оксана Станиславова и Алена Дзуцева, Soda Homedecor, спроектировали интерьер для коллекционера, ценителя современного искусства.

По теме: Пол Тейс: квартира с артом для главного редактора

Квартира площадью 53 кв. метра находится в старом районе Москвы. Отсюда элементы классической стилистики в интерьере: авторы проекта хотели, чтобы внутреннее пространство квартиры было под стать архитектуре дома и видам из окна.

На стене справа диптих «Персона» Алексея Ланцева. Над тумбой в спальне фоторабота Бориса Смелова «Аполлон с пауком».

На выбор стилистического решения повлияли и особенности квартиры: высокие потолки, эркер, гипсовые полуколонны и лепнина, которые были здесь изначально. В то же время необходимо было создать современную атмосферу и обеспечить подходящий фон для арт-объектов. Поэтому основным цветом стал белый: в него выкрашены все стены и потолки, чтобы картины и скульптуры смотрелись ярче.

Оксана Станиславова и Алена Дзуцева Soda Homedecor Гостиная. Вся мебель выполнена на заказ в Мастерской Jila, мягкая мебель выполнена на заказ в UNICO Posh. Ковер Kover Buro. Зеркало на камине Мастерская Кати Гердт. Гостиная-кухня. Слева на стене фоторабота Ивана Бойко «Время серебра». Справа в зоне кухни работа Георгия Пузенкова «Собака». Скульптуры «Толстушки», Milu.

Чтобы сделать пространство более открытым, гостиную и кухню объединили. Выбранную эстетику здесь подчеркивают камин с мраморным порталом, бархатистая обивка мягкой мебели, изготовленной на заказ, эффектная люстра, тяжелые шторы, подобранные в цвет московского неба. На полу — традиционный дубовый паркет.

Гостиная-кухня. Слева на стене фоторабота Ивана Бойко «Время серебра». Справа в зоне кухни работа Георгия Пузенкова «Собака». Скульптуры «Толстушки», Milu.

Кухонный гарнитур выбрали в цвет стен — белоснежный. Так из зоны гостиной он не бросается в глаза, но при близком рассмотрении обращает на себя внимание столешницей и кухонным фартуком из гранита.

Спальня. Изголовье оформлено шпоном. Спальня. Над тумбой фоторабота Бориса Смелова «Аполлон с пауком».

В обособленной спальне минимум мебели. Визуальная доминанта —  лаконичное изголовье кровати, оформленное в виде ниши панелями в оттенке натуральной древесины. «Решение о декоративных приемах и планировочном решении принято было единодушно, — говорят дизайнеры. — Работа была на одном дыхании».

Скульптура, Pitta Luga. Оксана Станиславова и Алена Дзуцева.

Симс 4 интерьер. Клевый интерьер для Симов в Симс 4.

Интерьер в Симс 4 требует особого подхода и усидчивости игрока. Красиво и грамотно подобрать дизайн интерьера не так то просто! Выберите подходящую мебель и технику, чуточку декора и можно заселяться в комнату.

Гостиная «Beam Living Part 01»

Минималистичная гостиная с крутой дизайнерской мебелью и точечным освещением. 17 объектов: диваны (4 вида), кушетки (2 вида), кресло, пуф, журнальные.

Кухня «The Brownstone Collection — Part One»

Первая часть коллекции «The Brownstone Collection». Современная минималистичная кухня для симов с утонченным вкусом. 22 объекта: кухонные тумбы (5 видов),.

Стереосистемы «TINY STEREOS»

Извлеченные стереосистемы из стенок «Марафонец» (каталог «Компактная жизнь») теперь в виде отдельной техники в 7 и 4 цветовых решениях. Проверено.

Сет для ванной комнаты «RUSTIC BATHROOM»

12 объектов: раковина, зеркало, бра, средства для ухода за кожей (4 образца), щетки для тела, полотенце, деревянный табурет, растение в.

Шторы «Simplicity Shade»

Реколор стандартных штор «Простота бытия» теперь в 2 видах «глухие» и полупрозрачные и в 78 цветовых вариантах. Проверено на лицензионной версии.

Столовая «Indigo Dining room»

Необычная красочная столовая в 6 пастельных образцах. 7 объектов: обеденный стол, стулья (2 вида), высокая полка, настенные зеркала (малое и.

Набор полок «ISOBEL SET»

Оригинальные дизайнерские полки из камня в 3 видах (книжный шкаф, декоративный столик, полка) и в 4 цветовых образцах. Проверено на.

Спальня «INSOMNIA»

6 объектов: каркас кровати, постельное белье, шкаф-комод, ковер, растение в горшочке и свеча в подсвечнике в виде черепа птицы. Всё.

Картина «ROB BAILEY PRINTS»

Реколор картины «Это старье» из дополнения «Путь к славе» (дополнение НЕОБХОДИМО). Теперь в 44 новых свотчах (больше вариантов на гиф.

Определение интерьера от Merriam-Webster

in · te · ri · или | \ in-ˈtir-ē-ər \ 1 : лежит, встречается или функционирует в ограничивающих границах : внутренний внутренняя точка треугольника

2 : принадлежность к умственной или духовной жизни простое внутреннее благочестие

3 : принадлежность к внутренней структуре или скрытой природе чего-либо внутренний смысл стихотворения

4 : вдали от границы или берега.

1 : внутренняя или духовная природа : характер

2 : внутренняя часть (страна или остров)

4 : внутренние дела государства или нации

5 : изображение (как в пьесе или фильме) интерьера здания.

О интерьере | U.

S. Департамент внутренних дел

Представительство

Министерство внутренних дел США защищает и управляет природными ресурсами и культурным наследием страны; предоставляет научную и другую информацию об этих ресурсах; и соблюдает свои доверительные обязательства или особые обязательства перед американскими индейцами, коренными жителями Аляски и аффилированными островными сообществами.

Что мы делаем

Министерство внутренних дел играет центральную роль в том, как Соединенные Штаты управляют своими государственными землями, усиливают защиту окружающей среды, добиваются экологической справедливости и уважают наши межнациональные отношения с племенами.

Наши приоритеты

Наш мандат от президента Байдена ясен: мы должны решить четыре пересекающиеся проблемы COVID-19, восстановление экономики, расовое равенство и изменение климата. Прочтите наши приоритеты, чтобы узнать, как мы справимся с масштабом наших проблем и множеством пересекающихся кризисов.

Видение

Департамент внутренних дел стремится реализовать видение:

• Содействовать энергетической безопасности и разработке важнейших полезных ископаемых для создания рабочих мест для американцев, оградить нашу страну от нестабильных политических событий за рубежом, обеспечить дополнительную энергетическую безопасность союзникам за счет избыточных внутренних поставок и обеспечить доход для всех уровней правительства, чтобы они, в свою очередь, имели ресурсы, чтобы лучше служить американскому народу.
• Расширить доступ к возможностям отдыха на свежем воздухе для всех американцев , чтобы наши люди могли быть более здоровыми, более полно наслаждаться прекрасными особенностями своих федеральных земель и пользоваться охотой, рыбалкой и другими видами отдыха на свежем воздухе, которые являются корнями природоохранное движение.
• Усилить охрану окружающей среды , при которой все уровни правительства и частные землевладельцы работают вместе в атмосфере взаимного уважения для достижения общих целей управления природными ресурсами на разных ландшафтах.
• Улучшить управление видами и их средами обитания , сосредоточив наши финансовые и кадровые ресурсы на улучшении состояния рыб и диких животных в нашей стране и здоровых сред обитания, которые их поддерживают, а также за счет оптимизации бюрократии, чтобы помочь нам продуктивно тратить относительно больше наших финансовых средств на основа для лучшего удовлетворения общественных потребностей и наших собственных обязанностей по управлению природными ресурсами.
• Поддерживать доверие и связанные с этим обязанности , признавая важность межправительственных отношений с индейскими племенами, коренными жителями Аляски и островными территориями, а также уважая самоопределение и суверенитет.

— Департамент внутренних дел Стратегический план на 2018-2022 финансовые годы

Подробнее о интерьере

Для полиции парка: «Мама сообщила о применении силы» — среда, 19 мая 2021 г. — www.eenews.net

В июне прошлого года два офицера полиции парка США были назначены повторно после того, как на видео было видно, как они били двух австралийских журналистов дубинкой. и щит, когда они помогли разогнать мирную демонстрацию возле Белого дома.

Почти год спустя полиция парка сообщила, что расследование дела продолжается.

Эксперты по охране правопорядка говорят, что полицейскому департаменту очень долго, чтобы завершить расследование о применении силы и сообщить о результатах. Но сторонние наблюдатели из полиции парка говорят, что это обычное дело для правоохранительных органов, привыкших работать без особого надзора или публичного раскрытия информации.

Эта практика в настоящее время подвергается большему контролю со стороны общественности и законодателей, которые отметили, что стало недопустимо трудно получить доступ даже к основным сводным данным о жалобах офицеров или применении силы против гражданских лиц.

Эти отчеты обычно публикуются полицией и департаментами шерифа по всей стране.

«Это очень неприятно — это очень черный ящик», — сказал член палаты представителей Дон Бейер, демократ из Вирджинии и давний критик полиции парка, который считает, что Конгрессу пора вмешаться.

В течение трех с половиной лет Бейер и другие избранные должностные лица пытались получить ответы у полиции парка по делу 25-летнего Биджана Гайсара, бухгалтера, который умер в ноябре 2017 года после того, как в него два офицера выстрелили 10 раз. остановка движения в Вирджинии ( Greenwire , сентябрь.27, 2019).

После того, как Министерство юстиции отказалось привлечь к уголовной ответственности офицеров, в прошлом году большое жюри штата предъявило им обвинение в непредумышленном убийстве. Но с тех пор дело было передано в федеральный суд, где в августе судья решит, следует ли предоставить этим двум офицерам юридический иммунитет.

Пока дело продолжается, семья Гайсара заявила, что они все еще ждут, пока полиция парка сообщит какие-либо подробности о том, что пошло не так, или опубликует результаты любого внутреннего расследования.

«Задержки жестоки, но независимо от того, сколько времени это займет, мы продолжим борьбу», — говорится в заявлении семьи.

Объединившись с сенатором Тимом Кейном (Демократическая Республика Вирджиния), Бейер внес на рассмотрение законопроект, обязывающий правоохранительные органы сообщать генеральному прокурору США о неправомерных действиях полиции, включая любые урегулирования или обвинения в применении чрезмерной силы.

В случае с полицией парка Бейер сказал, что департамент должен публиковать ежемесячные сводки, чтобы держать общественность в курсе.

Одно время полиция парка публиковала годовой отчет, в котором содержалась сводка количества жалоб, поданных на ее сотрудников, но департамент не обновлял веб-страницу, на которой когда-то размещались эти документы, с 2015 года.

Если закон Бейера-Кейна станет законом, генеральный прокурор США будет обязан представлять Конгрессу ежегодный отчет о случаях неправомерного поведения и создавать базу данных с возможностью поиска в Интернете, которая позволит общественности получить доступ к данным полиции. Законопроект, получивший название «Закон о неправомерных действиях полиции», будет применяться ко всем полицейским управлениям, получающим федеральные деньги.

Бейер сказал, что большинство людей понятия не имеют, сколько тратится на неправомерные действия полиции, потому что правоохранительные органы часто улаживают дела тайно, что он охарактеризовал как «тихое похоронение критики и споров».«

« Вы не можете управлять тем, что не измеряете, — сказал Бейер. — Цель этого закона — максимально измерить проблему ».

Такой подход ознаменовал бы радикальные изменения для полиции парка и многих других. другие федеральные правоохранительные органы.

«Федеральные агентства никому ничего не говорят — это одна из самых больших неразберих», — сказал Ронал Серпас, профессор практики, криминологии и правосудия в Университете Лойолы и бывший суперинтендант полиции Нового Орлеана.Серпас возглавил полицейское управление Нового Орлеана, когда город подписал указ о федеральном согласии с Министерством юстиции, требующий изменений в работе агентства, в том числе с применением силы против гражданских лиц.

Серпас, который также работал начальником полиции в Нэшвилле и главой патруля штата Вашингтон, сказал, что федеральным правоохранительным органам разрешено действовать при гораздо меньшем общественном контроле, чем их коллегам в штате и на местном уровне.

Он сказал, что среднестатистические граждане гораздо реже взаимодействуют с узкоспециализированными федеральными агентствами по сравнению с местными полицейскими управлениями, которые расположены близко к земле и имеют «массовое воздействие» на общественность.

«Это как бы проскальзывает сквозь щели», — сказал Серпас. «Никто на самом деле не обращает на это внимания».

Парковая полиция, «скрытая в секрете»

Тогдаш. Деб Хааланд на слушаниях в Доме. Фото: Бонни Кэш-Пул / Getty Images

Тогдашний представитель. Дебра Хааланд на слушаниях Комитета по природным ресурсам Палаты представителей прошлым летом изучала реакцию полиции парка на протесты на площади Лафайет в Вашингтоне. Бонни Кэш-Пул / Getty Images

В то время, когда общественность требует большей подотчетности и прозрачности от правоохранительных органов, многие надеются, что полиция парка изменится.

«В современных полицейских проблемах хорошо то, что они просто включают свет и сосредотачиваются на этом», — сказал Серпас.

В то время как Бейер надеется, что Конгресс присоединит свой закон к более широкому «Закону Джорджа Флойда о правосудии в полицейской деятельности», администрация Байдена может также начать требовать большего раскрытия информации.

В Министерстве внутренних дел секретарь Деб Хааланд может потребовать от нескольких агентств, находящихся под ее юрисдикцией, внести изменения в правила, регулирующие работу 3 366 сотрудников правоохранительных органов, нанятых этим отделом, говорят наблюдатели.

Сюда входят 560 сотрудников полиции парка в Вашингтоне, Нью-Йорке и Сан-Франциско и почти 1500 рейнджеров Службы национальных парков, более 500 сотрудников Бюро по делам индейцев и сотни других сотрудников Службы охраны рыб и дикой природы и Бюро землеустройства, согласно декабрьскому отчету Исследовательской службы Конгресса США.

«Я очень надеюсь — полиция парка — это легко исправить», — сказал Артур Аго, директор проекта уголовного правосудия Комитета юристов по гражданским правам в соответствии с законом. «В администрации, если есть решительные голоса за реформу полиции, полиция парка — легкая цель для их работы. Все в ней относительно скрыто в секрете, так что это легкая цель».

Хааланд, которая начала свою новую работу в марте, не объявила о каких-либо изменениях в отделе, а представитель сказал, что у нее нет комментариев.

Как член Конгресса в прошлом году, Хааланд был одним из самых яростных критиков полиции парка, которая была создана в 1791 году и считается старейшим федеральным правоохранительным органом страны.

После того, как полицейские парка разогнали толпу протестующих на площади Лафайет, чтобы позволить тогдашнему президенту Трампу перейти улицу и сфотографироваться, Хааланд сказал, что они продемонстрировали «чрезмерное применение силы» и что инцидент «не повлечет за собой последствий». сомнения остаются одним из самых мрачных дней »президентства ( E&E Daily , 30 июня 2020 г.).

На контрольном слушании комитета по природным ресурсам Палаты представителей в июне прошлого года Хааланд сказал, что нападение на протестующих было «ни в коем случае не единичным инцидентом», сославшись на убийство Гайсара в качестве доказательства.

«В ноябре 2017 года полиция парка США убила Биджана Гайсара прямо над рекой в ​​Арлингтоне», — сказала она. «Убил его, когда он вел свою машину. Тем не менее, его семья не добилась справедливости».

В феврале, когда Служба национальных парков объявила о приеме на работу ветерана агентства Памелы Смит на должность начальника полиции парка, высшие должностные лица NPS заявили, что скоро будут внесены изменения ( E&E News PM , 25 февраля).

«В ближайшие месяцы руководство Службы национальных парков вместе с шефом Смитом изучит возможности, призванные укрепить приверженность нашей организации прозрачности, — сказал заместитель директора NPS Шон Бенж.

Для начала Смит сообщила репортерам, что планирует оснастить всех полицейских парка нательных камер к концу года, добавив, что этот шаг укрепит общественное доверие и «он также способствует прозрачности и подотчетности».

Смит также пообещал рассмотреть дело Гейсара, заявив: «Одна из моих первоочередных задач как начальника полиции — быть проинформированным о том, что произошло».

Помимо этого, Смит не раскрывала никаких других планов в отношении отдела с тех пор, как она заняла свое место в феврале.28, а пресс-секретарь полиции парка заявила, что она не может быть допрошена до конца мая или начала июня «из-за других обязательств».

С новым начальником и новой администрацией, Бейер назвал это «идеальным временем» для департамента, чтобы внести больше изменений и «принести прозрачность полиции парка в 21 век и делать это без страха». »

«И на самом деле, как мы видели во многих случаях, когда вы начинаете быть прозрачными с людьми, они все расслабляются и немного расслабляются», — сказал Бейер, который работал смотрителем парка NPS в начале 1970-х. .«Это не плохо, это хорошо».

Теперь, когда полицейские службы по всей стране находятся в центре внимания, Джонатан Джарвис, который курировал полицию парка, когда он служил директором NPS при президенте Обаме с 2009 по 2017 год, сказал, что пришло время для полиции парка и других правоохранительных органов во внутренних делах. Департамент «быть открытым».

«Я бы сказал, что особенно в наше время полиция парка США, а также все отделы внутренних дел должны ошибаться в сторону общественной прозрачности», — сказал он.«Они должны говорить об этом, быть открытыми».

«Это не дворцовые секреты»

Полиция парка США на площади Лафайет. Фото: Дрю Ангерер / Getty Images

Протестующие столкнулись с полицией парка США после попытки снести статую Эндрю Джексона на Лафайет-сквер возле Белого дома 22 июня 2020 года в Вашингтоне. Дрю Ангерер / Getty Images

Серпас сказал, что полиция парка и другие агентства должны следовать основному правилу при сообщении своих данных.

«На самом деле это очень просто: чем больше, тем лучше, тем меньше, тем хуже», — сказал он. «Федеральные правоохранительные органы могли бы делать гораздо больше публичных отчетов — это не дворцовые секреты».

В целом, сказал Аго из Комитета юристов по гражданским правам в соответствии с законом, он поставил бы полиции парка оценку D за ее прозрачность.

«Может быть, D желает, потому что у них новый начальник, который поднимает шум о прозрачности, но если бы мы повернули время вспять, когда г-нГайсар был убит, это определенно будет F, — сказал он. — Сопротивление, которое они оказали в этом случае, было настолько сильным ».

Среди прочего, он критиковал полицию парка за то, что она не раскрыла имена офицеры, участвовавшие в стрельбе в Гайсаре. Этого не произошло, пока судья не приказал агентству сделать это.

Серпас сказал, что это необычный способ для полицейского управления раскрывать информацию: «Из всех полицейских управлений, с которыми я был знаком , обнародование информации об офицерах должно было произойти в первые несколько часов.«

Аго, который свидетельствовал о неправомерных действиях полиции на слушании перед комиссией Комитета по природным ресурсам Палаты представителей в сентябре прошлого года, призвал полицию парка и другие правоохранительные подразделения внутренних дел« выйти из темного века »( E&E Daily , сентябрь 30, 2020).

В отличие от многих государственных и местных полицейских управлений, сказал Аго, подразделения внутренних дел «не смогли провести многие из самых основных реформ, которые увеличивают подотчетность и прозрачность». Он привел два примера: они работают без гражданских обзорные комиссии и записи о неправомерных действиях их сотрудников не являются общедоступными.

Аго обнаружил, насколько мало публичных сообщений делает полиция парка, когда он обнаружил, что последний годовой отчет, опубликованный полицией парка в Интернете, был в 2013 году.

NPS не сказал, почему с тех пор не публиковалось никаких отчетов или почему полиция парка больше не публикует сводные данные по жалобам с участием офицеров.

«Расследования предполагаемых неправомерных действий федеральных служащих регулируются Законом о конфиденциальности», — сказал представитель NPS. «Запросы на соответствующие отчеты обрабатываются и публикуются в соответствии с применимыми законами и нормативными актами, включая FOIA [Закон о свободе информации] и Закон о конфиденциальности.

Аго сказал, что такой ответ является стандартным для полицейских управлений, которые хотят держать общественность в неведении.

«Они откровенно не реагируют на нас», — сказал он. запрашивая эти записи: они всегда ссылаются на конфиденциальность, даже в ситуациях, когда законы о конфиденциальности не применяются ».

В своем заявлении семья Гайсар сказала, что они испытали« бесконечные задержки, препятствия и препятствия в нашем стремлении к справедливости для Биджана ». и выразил надежду, что полиция парка скоро сменится новым начальником.

«После более чем трех лет молчания и отсутствия руководства мы надеемся, что шеф Смит откроет новую эру честности и прозрачности для полиции парка с упором на безопасность сообщества в целом», — заявила семья.

Что касается ссоры 1 июня с австралийскими журналистами, лейтенант Джонатан Хоффлингер, исполнительный директор Управления полиции Парка, заявил, что «новой информации для сообщения нет».

«Инцидент расследуется У.«Отделение внутренних дел полиции С. Парк», — сказал он в электронном письме.

Аго назвал «смехотворно долгим сроком для продолжения расследования» инцидента, в то время как Серпас сказал, что единственная причина, которая могла бы оправдать такую ​​долгую задержку, — это наличие особенно необычные обстоятельства.

«Они могут быть там, но если их нет, то год — это просто смешно, — сказал он. — Я не могу поверить, что на расследование уходит столько времени».

ClpAP и ClpXP деградируют белки с метками, расположенными внутри первичной последовательности

Реферат

АТФаз Clp / Hsp100 составляют большое семейство АТФ-зависимых шаперонов, некоторые из которых являются регуляторными компонентами двухкомпонентных протеаз.Субстратная специфичность заключается в белке Clp, и в настоящее время считается, что белки Clp распознают мотивы, расположенные рядом с одним или другим концом субстрата. Мы проверили, могут ли ClpA и ClpX распознавать метки, когда они расположены внутри первичной последовательности субстрата. Белок с меткой распознавания ClpA на конце NH ₂ , плазмида P1 RepA, сливали с концом COOH зеленого флуоресцентного белка (GFP). GFP не распознается ClpA или ClpX и не ухудшается ClpAP или ClpXP.Мы обнаружили, что ClpA связывает и разворачивает гибридный белок, а ClpAP разрушает белок. Обе части слитого белка, GFP и RepA, разлагаются. Белок с COOH-концевой меткой ClpX, MuA, был слит с концом NH ₂ GFP. ClpXP разрушает MuA-GFP, однако скорость в 10 раз ниже, чем у GFP-MuA. Часть MuA, но не часть GFP MuA-GFP, ухудшается. Таким образом, субстрат с внутренним мотивом распознавания ClpA может разворачиваться с помощью ClpA и разрушаться с помощью ClpAP.Сходным образом, хотя и менее эффективно, ClpXP разрушает субстрат с внутренним мотивом распознавания ClpX. Мы также обнаружили, что ClpA распознает NH ₂ -концевую 15 аминокислотную метку RepA, когда она сливается с концом COOH GFP. Более того, ClpA распознает тег RepA либо в аутентичной, либо в обратной ориентации.

АТФаз Clp / Hsp100 составляют большое семейство гомологичных АТФаз с АТФ-зависимой активностью молекулярных шаперонов. Они участвуют во многих клеточных функциях, включая репликацию ДНК, устойчивость к тепловому стрессу, контроль экспрессии генов и деградацию белка (1, 2).Несколько белков Clp, включая Escherichia coli ClpA, ClpB и ClpX и дрожжевой Hsp104, действуют в реакциях ремоделирования белков in vitro , таких как разборка комплексов и реактивация и дезагрегация денатурированных белков (3-7). Кроме того, некоторые белки Clp играют прямую роль в деградации белков, связываясь с протеолитическим компонентом с образованием АТФ-зависимых протеаз. Например, ClpA, ClpX и HslU из E. coli являются АТФазными компонентами ClpAP, ClpXP и HslUV соответственно (8, 9).

Структурные исследования показали, что Clp-АТФазы самоорганизуются в олигомерные кольца в присутствии АТФ или негидролизуемых аналогов АТФ (10, 11). Когда они связаны с протеолитическим компонентом, кольца АТФазы расположены на одном или обоих концах протеолитического ядра, образуя структуру, напоминающую эукариотическую протеасому 26S (10, 12). Кристаллические структуры ClpP и HslV показывают, что протеолитические активные центры находятся во внутренней камере, образованной двумя уложенными друг на друга кольцами идентичных субъединиц (13, 14).Доступ к протеолитической камере, по-видимому, осуществляется через узкие поры на обоих концах уложенных друг на друга колец. Однако поры размером около 10 Å в ClpP (13) недостаточно широки для прохождения глобулярных белков.

Путь протеолиза, предполагаемый структурными и биохимическими данными, заключается в том, что белковые субстраты специфически распознаются и разворачиваются компонентом АТФазы Clp, а затем проходят через апикальную пору компонента протеазы в протеолитическую камеру (2, 13, 15). .Аспекты этой модели были проверены. ClpA и ClpX специфически связываются с субстратами и опосредуют АТФ-зависимое белковое разворачивание меченых субстратов (16-19). Когда присутствует ClpP, развернутые субстраты перемещаются из ClpA или ClpX в полость ClpP АТФ-зависимым образом (19-21). В поддержку потоковой модели транслокации субстрата от Clp ATPase к протеазе недавние результаты показывают, что ClpAP и ClpXP деградируют субстраты процессивно, начиная с сигнала деградации (22, 23).

Первым этапом как ремоделирования белка с помощью шаперонов Clp, так и деградации протеазами Clp является распознавание субстрата и связывание с белком Clp. Для субстратов, изученных на сегодняшний день, Clp-АТФазы распознают либо NH ₂ -, либо COOH-концевую область субстрата. Для нескольких субстратов, включая MuA (4), репрессор Mu vir (24) и полипептиды, меченные SsrA (25–27), сайты в СООН-концевых последовательностях субстратов в первую очередь ответственны за распознавание ClpX и / или ClpA.Для других, включая определенные слитые белки с β-галактозидазой, несущие гидрофобные NH ₂ -концевые аминокислоты (28, 29), RepA (17, 30), HemA (31), UmuD ‘(32) и λO (33), распознавание осуществляется через сайты рядом с конечной точкой NH ₂ . Хотя было идентифицировано несколько специфических сигналов распознавания для ClpA и ClpX, общие правила последовательности, управляющие распознаванием субстрата любым белком, еще не очевидны.

Мы исследовали, могут ли метки распознавания субстрата перемещаться из их естественного положения около одного конца субстрата в другое место без нарушения способности меток способствовать ремоделированию с помощью ClpA и деградации с помощью ClpAP или ClpXP.Мы обнаружили, что ClpA распознает, разворачивается и перемещается в ClpP для деградации субстрата с меткой распознавания, расположенной внутри первичной последовательности субстрата. ClpXP также разрушает субстрат с помощью внутренней метки, однако для тестируемых субстратов, специфичных для ClpA и ClpX, деградация была намного более устойчивой с ClpAP, чем с ClpXP.

Экспериментальные процедуры

Материалы.

АТФ и γ-тио-АТФ (ATP [γS]) были получены от Roche Applied Science.Эндонуклеазы рестрикции и ДНК-модифицирующие ферменты были от New England Biolabs, а реагенты для ПЦР были от Perkin – Elmer Life Sciences.

Плазмиды и штаммы.

Для создания pBAD-RepA-GFP продукты ПЦР repA , содержащие 5 ‘ Nhe I и сайты связывания рибосом и сайт 3′ Kpn I, были разрезаны и лигированы с Nhe I- и Kpn I- расщепленный pBAD-GFP (GFP, зеленый флуоресцентный белок) (17).Для создания pET-GFP-RepA и pET-GFP-RepAΔ50 внутренний сайт Nde I в gfpuv был сначала удален с помощью мутагенеза ПЦР с pGFPuv (CLONTECH) в качестве исходного шаблона. Затем gfpuv ( Nde IΔ) амплифицировали с помощью ПЦР и стоп-кодон удаляли с помощью Nde I, содержащего 5 ‘и 3’ олигонуклеотиды. Продукт расщепляли с помощью Nde I и лигировали с расщепленными Nde I pET-RepAH ₆ и pET-RepAΔ50H ₆ .pET-RepAH ₆ и pET-RepAΔ50H ₆ были сконструированы путем создания repA ПЦР-фрагментов, кодирующих RepA (аминокислоты 1–286) и RepAΔ50 (аминокислоты 51–286), которые содержат 5 ‘и 3’ Nde I и Hin dIII сайтов соответственно. Продукты расщепляли с помощью Nde I и Hin dIII и лигировали с расщепленным аналогичным образом pET24b (Novagen). Для конструирования pBAD-GFP-RepA (1-15) и pBAD-GFP-RepA (15-1) 3′-концевой сайт Sac I в gfpuv использовали для вставки отожженных олигонуклеотидов с получением слитых белков, содержащих аминокислоты RepA. 1-15 сливаются с концом COOH GFPuv в аутентичном порядке 1-15 и инвертированном порядке 15-1.

Для конструирования pET-EGFP-L-MuA был создан усиленный ПЦР-фрагмент GFP (EGFP) (без стоп-кодона) с использованием pEGFP (CLONTECH) в качестве матрицы и Nde I-сайт, содержащий 5 ‘и 3’ олигонуклеотиды. Фрагмент ПЦР egfp и фрагмент ПЦР muA , фланкированные сайтами Bam HI, были индивидуально клонированы в сайт Nde I и сайт Bam HI, соответственно, в pET-3a (Novagen). Для создания pET-MuA-EGFP и pET-MuAΔ48-EGFP фрагмент ПЦР egfp был сначала клонирован между сайтами Nde I и Bam HI в pET-3c.Полученную плазмиду расщепляли Nde I и лигировали с ПЦР-фрагментом muA соответствующей длины, фланкированным сайтами Nde I.

Все слитые последовательности проверяли секвенированием ДНК.

Белки и ДНК.

P1 RepA (34), ClpA (35), ClpX (36) и ClpP (35) очищали, как описано. GFP, RepA-GFP, RepA (1–15) -GFP, GFP-RepA (1–15) и GFP-RepA (15–1) были выделены из клеток SG22215, несущих плазмиды, экспрессирующие эти белки, как описано (17).

GFP-RepAH ₆ и GFP-RepAΔ50H ₆ были выделены из клеток BL21 (DE3), несущих pET-RepAH ₆ и pET-RepAΔ50H ₆ , соответственно, после индукции в течение ночи с 0,1 мМ изопропила β-d- тиогалактозид (IPTG) при 23 ° C. Слитые белки очищали аффинной хроматографией с иммобилизованным металлом, используя смолу Talon (CLONTECH), как рекомендовано производителем.

слитых белков MuA-GFP, GFP-L-MuA и MuAΔ48-GFP выделяли из клеток BL21 (DE3), несущих плазмиды, экспрессирующие слитые гены.Клетки выращивали в LB-бульоне, содержащем 100 мг / мл ампициллина, при 27 ° C до OD ₆₀₀ из 1. Добавляли IPTG до 0,4 мМ и через 4 часа после индукции клетки собирали центрифугированием при 4 ° C. Очистку гибридных белков проводили, как описано для MuA (37). Конечные белковые растворы диализовали против 25 мМ Hepes, pH 7,6 / 500 мМ KCl / 0,1 мМ EDTA / 1 мМ DTT / 10% глицерина (об. / Об.).

GroEL (D87K) получали, как описано (38). Плазмида, используемая для экспрессии GroEL (D87K), любезно предоставлена ​​Артуром Хорвичем (Йельский университет).

RepA был ³ H-мечен in vitro с использованием N -сукцинимидил [2,3- ³ H] пропионата (20). Концентрации белка выражены в молярных количествах димеров RepA, RepA-GFP, GFP-RepA и GFP-RepAΔ50, гексамеров ClpA и ClpX, тетрадекамеров ClpP и GFP-L-MuA, MuA-GFP, MuAΔ50-GFP, RepA (1 –15) -GFP, GFP-RepA (1–15) и GFP-RepA (15–1) мономеры.

[ ³ H] ori плазмидную ДНК P1 (3800 имп / мин / фмоль) получали, как описано (39).

Анализ активации RepA.

Реакционные смеси (20 мкл) содержали буфер A [20 мМ Tris⋅HCl, pH 7,5 / 100 мМ KCl / 5 мМ DTT / 0,1 мМ EDTA / 10% глицерина (об. / Об.)], 1 мМ АТФ, 10 мМ MgCl _2, 50 мкг / мл BSA, 0,005% Triton X-100, 0,07 пмоль ClpA и RepA, как указано. Через 10 мин при 23 ° C смеси охлаждали до 0 ° C. Добавляли ДНК тимуса теленка (1 мкг) и 14 фмоль [ ³ H] ori P1 плазмидной ДНК. Через 5 мин при 0 ° C смеси фильтровали через нитроцеллюлозные фильтры и измеряли остаточную радиоактивность.

Анализы деградации.

Реакционные смеси собирали в 100 мкл буфера A / 20 мМ MgCl ₂ /5 мМ АТФ / 20 мМ креатинфосфат / 6 мкг креатинкиназы / ClpA или ClpX, ClpP и гибридное производное RepA или MuA, как указано в фигура легенды. Уменьшение относительной флуоресценции измеряли при 23 ° C как функцию времени с использованием люминесцентного спектрофотометра Perkin-Elmer LS50B, снабженного устройством для чтения планшетов с лунками. Длины волн возбуждения и испускания составляли 395 нм и 510 нм для GFP-содержащих слитых соединений и 475 нм и 510 нм для EGFP-содержащих слияний.

Альтернативно, реакционные смеси собирали, как указано выше, и после инкубации при 23 ° C в течение указанного времени добавляли трихлоруксусную кислоту (TCA) до 20% (вес / объем). Осадки TCA анализировали с помощью SDS / PAGE и количество субстрата количественно определяли денситометрией.

Анализ разворачивания RepA-GFP.

Слитые белки

GFP инкубировали с 200 пмоль ClpA в 100 мкл реакционных смесей, содержащих буфер A, 100 мкг / мл BSA, 0.005% Triton X-100, 5 мМ АТФ, 20 мМ креатинфосфат и 6 мкг креатинкиназы. Развертывание белка измеряли, как описано выше для анализа флуоресцентного протеолиза, но не учитывали ClpP. Где указано, смеси содержали 2,5 мкМ GroEL (D87K).

Результаты

ClpA распознает одну и ту же метку, когда она находится на конце NH

₂ или COOH белка и когда она находится в своей аутентичной или обратной ориентации.

Мы хотели знать, может ли мотив распознавания ClpA функционировать как метка при перемещении из своего нормального положения на одном конце субстрата на другой конец.Нам также было любопытно, можно ли распознать тег в обратной ориентации. P1 RepA был выбран для этих исследований, потому что это хорошо охарактеризованный субстрат для ремоделирования с помощью ClpA и для деградации с помощью ClpAP (3, 17, 20). GFP был выбран потому, что ClpA не распознает его (16, 17). Ранее мы показали, что тег RepA расположен между аминокислотами 10 и 15 (30). Более того, когда NH ₂ -концевой 15 аминокислот RepA размещается на NH ₂ конце GFP, метки достаточно для нацеливания слитого белка на разворачивание с помощью ClpA и деградацию с помощью ClpAP (30).Мы сконструировали слитые белки, в которых NH ₂ -концевая 15-аминокислотная метка RepA была присоединена к COOH-концу GFP в аутентичном GFP-RepA (1–15) и обратном GFP-RepA (15–1 ) ориентации, для сравнения с гибридным белком, в котором NH ₂ -концевые 15 аминокислот RepA были слиты с NH ₂ концом GFP, RepA (1–15) -GFP (Рис. 1 A ) .

Рис 1.

Разворачивание слитых белков GFP, содержащих NH ₂ — или COOH-концевые теги RepA.( A ) Подложки GFP с тегами RepA. ( B ) Установившееся развертывание RepA (1–15) -GFP (синие кружки), GFP-RepA (1–15) (красные треугольники) и GFP-RepA (15–1) (черные квадраты) в наличие ClpA (закрашенные символы) и отсутствие ClpA (светлые символы). Реакции разворачивания проводили, как описано в экспериментальных процедурах , используя 1 мкМ субстрата и 2 мкМ ClpA, где указано. Флуоресценцию отслеживали с течением времени. ( C ) Разворачивание в присутствии GroEL (D87K) RepA (1–15) -GFP (синие кружки), GFP-RepA (1–15) (красные треугольники) и GFP-RepA (15–1) (черные квадраты) при наличии (закрашенные символы) или отсутствии (незакрашенные символы) ClpA.Реакции проводили, как в B , за исключением того, что к смесям добавляли 2,5 мкМ GroEL (D87K).

Мы проверили, разворачивает ли ClpA слитые белки GFP. Лаборатория Хорвич показала, что разворачивание белка с помощью ClpA может быть обнаружено путем мониторинга снижения флуоресценции меченого слитого белка GFP после инкубации с ClpA и АТФ в присутствии GroEL (D87K), мутантной формы GroEL (38), которая связывает и секвестры развернутых белков (16).Когда GFP-RepA (1-15), GFP-RepA (15-1) и RepA (1-15) -GFP инкубировали с ClpA и АТФ, интенсивность флуоресценции всех трех субстратов снижалась на 10-20%, что указывает на установившееся разворачивание и рефолдинг (Рис. 1 B ). Не было изменений во флуоресценции этих субстратов без ClpA (фиг. 1 B ) или GFP с или без ClpA (данные не показаны; ссылки 16, 17). Когда GroEL (D87K) был добавлен к реакционным смесям разворачивания ClpA для улавливания развернутых белков, высвобождаемых ClpA, флуоресценция GFP-RepA (1-15) уменьшалась на 90%, GFP-RepA (15-1) уменьшалась на 60%, а RepA ( 1–15) -GFP снизился на 20% (рис.1 С ). Более развернутый GFP был захвачен GroEL (D87K), когда метка была расположена на конце COOH по сравнению с концом NH ₂ GFP. Эти результаты показывают, что метка нацелена на GFP для разворачивания с помощью ClpA, когда она расположена на любом конце белка и в любой ориентации.

Затем мы измерили деградацию слитых белков GFP, меченных NH ₂ и COOH-концом, под действием ClpAP. Около 90% GFP-RepA (1–15) разложилось за 10 мин, что было измерено по уменьшению флуоресценции.GFP-RepA (15–1) и RepA (1–15) -GFP разлагались медленнее; 50% флуоресценции было потеряно за 20 мин (рис. 2 A ). Флуоресценция GFP не изменялась при инкубации с ClpAP (данные не показаны; ссылки 16 и 17). Разложение подтверждали количественной оценкой исчезновения белков с помощью SDS / PAGE. После 20-минутной инкубации с ClpAP в условиях, показанных на рис. 2 A , 87% GFP-RepA (1–15), 47% GFP-RepA (15–1) и 43% RepA (1–15) -GFP деградировали.Мы наблюдали, что GFP, содержащий COOH-концевое удлинение из 10-аа, которое, как было известно, не являлось меткой распознавания ClpA, разлагалось примерно на 10% после 20-минутной инкубации с ClpAP в тех же условиях, что и на фиг.2 A ( данные не показаны).

Рис 2.

Расщепление слитых белков GFP, содержащих NH ₂ — или COOH-концевые теги RepA, с помощью ClpAP и ClpXP. ( A ) Разложение RepA (1–15) -GFP (синие кружки), GFP-RepA (1–15) (красные треугольники) и GFP-RepA (15–1) (черные квадраты) под действием ClpAP.Разложение субстратов GFP измеряли, как описано в экспериментальных процедурах , с использованием 1 мкМ субстрата в присутствии 1 мкМ ClpA и 1 мкМ ClpP (закрашенные символы) или в отсутствие ClpAP (светлые символы). Флуоресценцию отслеживали с течением времени. ( B ) Разложение GFP-RepA (1–15) (закрашенные красные треугольники), GFP-RepA (15–1) (закрашенные черные квадраты) и GFP-SsrA (закрашенные зеленые кружки) под действием ClpXP. Разложение измеряли, как описано в экспериментальных процедурах , с использованием 1 мкМ субстрата, 0.5 мкМ ClpX и 0,5 мкМ ClpP.

Таким образом, одна и та же метка может способствовать деградации нераспознанного в противном случае субстрата, GFP, независимо от положения метки на NH ₂ или COOH-конце белка. Как эксперименты по разворачиванию, так и по деградации предполагают, что ClpA более эффективно способствует разворачиванию GFP, когда метка находится на конце COOH GFP, чем когда она находится на конце NH ₂ GFP. Наблюдение за тем, что тег распознается, когда он находится в обратной ориентации, показывает, что взаимодействие ClpA с последовательностью тега не требует определенной ориентации, хотя слияние, содержащее аутентично ориентированный тег, более эффективно разворачивалось с помощью ClpA и ухудшалось с помощью ClpAP.

Затем мы проверили, распознаются ли субстраты GFP с COOH-концом специфически ClpAP, а не ClpXP. Когда ClpXP инкубировали с GFP-RepA (1–15) или GFP-RepA (15–1), не было обнаруживаемой потери флуоресценции (рис. 2 B ) или исчезновения субстратов с помощью SDS / PAGE (данные не указаны. показано). В тех же условиях ClpXP деградировал GFP-SsrA, как показано ранее (фиг. 2 B ; ссылки 18 и 19). Таким образом, тег RepA специфичен для ClpAP независимо от его местоположения или ориентации.

ClpA распознает теги, расположенные внутри первичной последовательности белка, и ClpAP разрушает субстраты с помощью внутренних тегов.

Чтобы ответить на вопрос, распознает ли ClpA субстрат, в котором сигнал распознавания перемещен из своего естественного положения около конца в положение внутри белка, мы сконструировали еще несколько гибридных белков, которые присоединили RepA к GFP. Тег RepA помещали внутрь первичной последовательности белка путем слияния NH ₂ -конца RepA с COOH-концом GFP (GFP-RepA).В качестве контроля производное RepA, лишенное первых 50 аминокислотных остатков RepA, было присоединено к COOH-концу GFP (GFP-RepAΔ50). Оба этих слитых белка содержали COOH-концевую метку His ₆ для облегчения очистки белка. Для сравнения, тег RepA оставляли в своем естественном положении NH ₂ -конца путем соединения COOH-конца RepA с GFP (RepA-GFP) (фиг. 3 A ).

Рис 3.

Комплексообразование между ClpA и GFP-RepA. ( A ) Слитые белки RepA и GFP.( B и C ) Гель-фильтрация GFP-RepA с ClpA ( B ) или отдельно ( C ). GFP-RepA (100 пмоль) инкубировали отдельно или с 400 пмоль ClpA в течение 10 минут при 23 ° C в 100 мкл смесей буфера S-200 [20 мМ Tris⋅HCl, pH 7,5 / 150 мМ KCl / 1 мМ EDTA. / 1 мМ DTT / 5% глицерин (об. / Об.) / 50 мкг / мл BSA / 10 мМ MgCl ₂ / 0,005% Тритон X-100], содержащий 2 мМ АТФ [γS]. Затем реакционные смеси наносили на колонку с Sephacryl S-200 0,7 × 15 см, уравновешенную буфером S-200, содержащим 0.5 мМ АТФ [γS]. Измеряли относительную флуоресценцию части каждой фракции. ( D и E ) Гель-фильтрация GFP-RepAΔ50 с ClpA ( D ) или отдельно ( E ).

Предыдущие эксперименты показали, что ClpA образует стабильные комплексы с RepA и RepA (1–70) -GFP, но не связывается с GFP (16, 17, 40). Чтобы определить, может ли ClpA распознавать субстрат с внутренней меткой, мы инкубировали GFP-RepA с ClpA и АТФ [γS] в условиях, которые поддерживают стабильное комплексообразование между ClpA и RepA, а затем анализировали смеси гель-фильтрацией.Примерно 75% GFP-RepA появилось в исключенном объеме колонки с ClpA, показывая, что GFP-RepA, как и RepA, имеет высокое сродство к ClpA (фиг. 3 B ). Поскольку флуоресценцию использовали для измерения положения элюирования слитого белка, результат также показывает, что часть GFP слитого белка не разворачивалась просто за счет связывания ClpA. В отсутствие ClpA GFP-RepA элюировался значительно позже в положении, ожидаемом для димерного GFP-RepA (фиг. 3 C ).Напротив, только около 20% GFP-RepAΔ50 элюировалось ClpA при гель-фильтрации, что указывает на то, что субстрат, лишенный NH ₂ -концевой метки RepA, имеет более низкое сродство к ClpA (фиг. 3 D ). При хроматографии отдельно GFP-RepAΔ50 элюируется в положении, ожидаемом для димерной формы (фиг. 3 E ). Эти результаты демонстрируют, что ClpA взаимодействует с субстратом, даже если мотив распознавания не находится рядом с концом белка.

Мы измерили установившееся разворачивание подложек (показано на рис.3 A ) путем мониторинга флуоресценции в присутствии ClpA и АТФ. Мы обнаружили, что при инкубации GFP-RepA или RepA-GFP с ClpA и АТФ интенсивность флуоресценции снижалась на 60–70% (рис. 4 A ). Было замечено, что со временем флуоресценция восстанавливается из-за истощения АТФ и спонтанного рефолдинга слитого белка GFP (30). Через 60 минут Rep-GFP восстановил 75% своей исходной флуоресценции, что свидетельствует о том, что слитый белок GFP реорганизовался в свою нативную конформацию (рис.4 А ). GFP-RepA медленно восстанавливал флуоресценцию, указывая на то, что часть GFP белка не высвобождалась из ClpA или не перестраивалась спонтанно в нативной конформации во время эксперимента. Когда GFP-RepAΔ50 инкубировали с ClpA и АТФ, флуоресценция снижалась примерно на 15% (фиг. 4 A ). Добавление GroEL (D87K), который связывал развернутый GFP-RepAΔ50, приводило к небольшому снижению флуоресценции (данные не показаны), указывая на то, что белок плохо разворачивался с помощью ClpA.Эти результаты предполагают, что ClpA способен способствовать АТФ-зависимому разворачиванию части GFP слитого белка, в котором сигнал распознавания ClpA расположен внутри между GFP и RepA.

Рис 4.

Разворачивание и активация GFP-RepA. ( A ) Установившееся разворачивание GFP-RepA (красные треугольники), RepA-GFP (черные кружки) и GFP-RepAΔ50 (синие квадраты) измеряли, как описано в экспериментальных процедурах с использованием 300 нМ субстрата и 2 мкМ ClpA. Флуоресценцию отслеживали с течением времени.( B ) Активацию ДНК-связывающей активности RepA (зеленые квадраты), RepA-GFP (черные кружки) и GFP-RepA (красные треугольники) измеряли после инкубации с ClpA (закрашенные символы) или без (белые символы) как описано в экспериментальных процедурах . Результаты представляют собой средние значения (± SEM) трех независимых экспериментов.

Обнаружив, что ClpA разворачивает GFP-RepA, мы подумали, что вполне вероятно, что ClpA может также активировать латентную ДНК-связывающую активность GFP-RepA, как и RepA дикого типа.В отсутствие ClpA GFP-RepA и RepA-GFP, подобно RepA, были неактивными в отношении ori P1-специфического связывания ДНК (фиг. 4 B ). Инкубация с ClpA и ATP активировала связывание ДНК ori P1 всеми тремя белками, хотя GFP-RepA и RepA-GFP были активированы в меньшей степени, чем RepA дикого типа (фиг. 4 B ). GFP-RepAΔ50 не тестировался в этом анализе, поскольку делеция первых 50 аминокислот ухудшает связывание ДНК с помощью RepA (30). Эти результаты демонстрируют, что ClpA способен ремоделировать RepA, который имеет внутренний сигнал распознавания ClpA.

Мы измерили деградацию слитых белков с внутренней меткой под действием ClpAP. GFP-RepA, RepA-GFP и GFP-RepAΔ50 инкубировали с ClpAP и АТФ, и разложение измеряли как по уменьшению флуоресценции, так и по исчезновению субстрата, как анализировали с помощью SDS / PAGE. Интенсивность флуоресценции как RepA-GFP, так и GFP-RepA снижалась с одинаковой скоростью, и через 30 минут наблюдалось снижение на 40-50% (рис. 5 A ). Сходную скорость деградации RepA-GFP и GFP-RepA наблюдали при количественной оценке исчезновения белков-субстратов с помощью SDS / PAGE (рис.5 В ). Продукты разложения не были обнаружены при гель-анализе, что указывает на то, что части GFP и RepA как RepA-GFP, так и GFP-RepA разлагались ClpAP до небольших полипептидов, как и ожидалось (35). GFP-RepAΔ50 также разлагался, но в 5 раз медленнее, чем GFP-RepA, что согласуется с результатами образования и развертывания комплекса (фиг. 3 D и 4 A ). Возможно, что COOH-концевой тег His ₆ способствует распознаванию GFP-RepAΔ50.Другие эксперименты показали, что скорость деградации RepAΔ50 без метки His ₆ составляет примерно 20% от скорости RepA дикого типа (данные не показаны), что позволяет предположить, что RepAΔ50 распознается ClpAP, но имеет более низкую аффинность, чем дикий тип. Предыдущая работа предположила, что вторичные мотивы распознавания ClpA существуют в RepA между аминокислотами 15 и 70 (30), и возможно, что остаточная деградация RepAΔ50 и GFP-RepAΔ50 может отражать присутствие альтернативных сайтов.

Рис 5.

Расщепление ClpAP слитых белков GFP, содержащих NH ₂ -концевые и внутренние теги распознавания. ( A ) RepA-GFP (черные кружки), GFP-RepA (красные треугольники) и GFP-RepAΔ50 (синие квадраты) (30 пмоль) инкубировали с 10 пмоль ClpA и 23 пмоль ClpP, как описано в Experimental Процедуры . Флуоресценцию отслеживали с течением времени. ( B ) Реакции были такими же, как в случае A , но в указанные моменты времени TCA добавляли до 20% (мас. / Об.).Осадки TCA анализировали с помощью SDS / PAGE, а разложение субстрата определяли денситометрией.

Взятые вместе, результаты слитого белка GFP-RepA демонстрируют, что ClpA может распознавать субстрат-связывающий мотив, когда он встроен во внутреннюю часть аминокислотной последовательности белка. Более того, результаты показывают, что субстрат с внутренней меткой может разворачиваться и реконструироваться с помощью ClpA и разрушаться с помощью ClpAP.

ClpXP ухудшает качество подложки с помощью внутренней метки.

Чтобы выяснить, обладает ли ClpAP уникальной способностью среди протеаз Clp разрушать субстраты с помощью внутренних тегов, мы проверили, может ли ClpXP разрушать субстрат с внутренними тегами. Транспозаза MuA была использована для этих экспериментов, потому что она разлагается ClpXP (4, 36). Мотив узнавания ClpX находится на 10-м конце COOH-конца. Слитый белок был сконструирован с GFP COOH-концом по отношению к MuA, располагая метку между частями MuA и GFP белка. Были изготовлены два контрольных слитых белка: один, в котором производное MuA, лишенное COOH-концевых 48 аминокислотных остатков, было слито с NH ₂ концом GFP, MuAΔ48-GFP, а один — с MuA COOH-концом для GFP, GFP-MuA, поместив метку в ее естественное положение COOH-терминала (рис.6 А ). Этот белок и несколько других, которые были протестированы, имели линкер из 14 аминокислот между частями слияния MuA и GFP. Однако не было обнаружено различий в способности слитых белков с линкерами и без них служить субстратами (данные не показаны).

Рис 6.

Расщепление ClpXP слитых белков GFP, содержащих COOH-концевые и внутренние теги распознавания. ( A ) Слитые белки GFP и MuA. ( B ) GFP-MuA (черные кружки), MuA-GFP (красные треугольники) и MuAΔ48-GFP (синие квадраты) (15 пмоль) инкубировали с 32 пмоль ClpX и 35 пмоль ClpP, как описано в Experimental Процедуры .Флуоресценцию отслеживали с течением времени. ( C ) Реакции разложения проводили, как в B , но содержали 20 мкг / мл BSA и проводились в 20 мкл. В указанное время добавляли TCA до 20% (вес / объем) и гранулы TCA анализировали с помощью SDS / PAGE. Деградацию оценивали денситометрией. Результаты представляют собой средние (± SEM) трех (для измерения деградации GFP-MuA) или пяти (для измерения MuA-GFP и MuAΔ48-GFP) независимых экспериментов. ( D ) Реакции разложения проводили, как в C , но после SDS / PAGE белки переносили на мембраны из поливинилидендифторида (PVDF) и проводили вестерн-блоттинг с использованием антитела GFP (CLONTECH).

Когда мы проверили, может ли ClpXP разрушать MuA-GFP и MuAΔ48GFP, измеряя флуоресценцию, не было обнаружено изменений флуоресценции (фиг. 6 B ). Напротив, ClpXP эффективно разрушает GFP-MuA, на что указывает быстрое снижение флуоресценции на 90% (фиг. 6 B ). Затем мы измерили деградацию путем количественной оценки исчезновения полосы субстрата с помощью SDS / PAGE и обнаружили, что результаты были несколько другими. В этом анализе MuA-GFP разложился.Однако он разлагался в 10 раз медленнее, чем GFP-MuA (рис. 6 C ). Также наблюдалась детектируемая деградация MuAΔ48GFP, хотя постоянно в 2–4 раза меньше, чем наблюдаемая с MuA-GFP (фиг. 6 C ). Для всех трех субстратов для разложения потребовались ClpX, ClpP и ATP. Таким образом, хотя степень деградации была очень небольшой, ClpXP сохранял некоторое предпочтение субстрату с внутренней меткой по сравнению с субстратом без метки.

Мы наблюдали, что, поскольку полосы MuA-GFP и MuAΔ48GFP исчезали со временем инкубации с ClpXP, появлялся продукт примерно на 3 кДа больше, чем GFP.Вестерн-блоттинг с использованием антитела GFP подтвердил, что продукты разложения содержат GFP (фиг. 6 D и данные не показаны). Это наблюдение объясняет очевидное несоответствие между отсутствием снижения флуоресценции и исчезновением субстрата при анализе SDS / PAGE и контрастирует с результатами с ClpAP, в которых промежуточные продукты деградации RepA-GFP или GFP-RepA не были обнаружены с помощью СТРАНИЦА.

Результаты с ClpXP демонстрируют, что ClpXP, как и ClpAP, разрушает субстрат, сигнал распознавания которого расположен внутри первичной последовательности белка.Однако ClpAP разрушает GFP-RepA намного эффективнее, чем ClpXP разрушает MuA-GFP.

Обсуждение

Представленные здесь результаты проливают свет на механизм распознавания субстрата и начала разворачивания Clp-АТФазами и деградации под действием Clp-протеаз. Мы показали, что ClpA связывает и разворачивает субстрат, метка распознавания которого расположена внутри первичной последовательности субстрата, и перемещает субстрат в ClpP для деградации.ClpXP также разрушает субстрат внутренним сигналом распознавания ClpX; однако ClpXP намного менее эффективен в этом процессе, чем ClpAP с двумя протестированными субстратами. Предполагается, что мотивы распознавания субстрата должны находиться рядом с концом, чтобы инициировать разворачивание и транслокацию белка от Clp-АТФазы через небольшую пору, ведущую в протеолитическую камеру протеолитического компонента. В соответствии с этим представлением, изученные на сегодняшний день субстраты (менее 10) обладают сигналами распознавания около одного конца.

Потоковая модель транслокации субстрата подтверждается недавним исследованием Horwich с соавторами (23). Их результаты с ClpAP продемонстрировали, что меченый конец SsrA-меченого субстрата на COOH-конце сначала входит в ClpP, что измеряется по флуоресцентной анизотропии субстратов, меченных флуоресцеином около одного или другого конца, и по флуоресцентному резонансному переносу энергии между донорными флуорофорами Полость ClpP и субстраты, меченные флуоресцеином. В другом недавнем исследовании Matouschek с соавторами (22) наблюдали, что и ClpAP, и ClpXP сначала разрушают домен белка, ближайший к метке распознавания.В этих экспериментах метка ClpA была слита с концом NH ₂ двух слитых белков, дигидрофолатредуктаза (DHFR) -барназа и барназа-DHFR, а метка ClpX была слита с концом COOH тех же двух слитых белков. Когда DHFR помещали рядом с сигналом распознавания ClpA или ClpX, метотрексат защищал как DHFR, так и барназу от деградации ClpAP и ClpXP, соответственно. Когда рядом с меткой находилась барназа, метотрексат защищал от деградации только домен DHFR.Оба этих исследования показывают, что деградация происходит из-за положения метки.

Для субстратов с внутренней меткой неизвестно, входит ли в ClpP первым немеченый конец или петля в развернутой полипептидной цепи. Исследования Burton et al. (41) продемонстрировали, что пора, через которую развернутые белки попадают в протеолитическую камеру ClpP, достаточно велика, чтобы вмещать одновременное прохождение двух полипептидных цепей. Они наблюдали, что ClpXP способен разрушать сшитые дисульфидом SsrA-меченные димеры репрессора Arc.Исследования Hoskins et al. (17) показали, что немаркированные белки, которые не связываются с ClpA в своей нативной форме, могут разрушаться с помощью ClpAP, когда АТФ-зависимая стадия разворачивания обходится путем разворачивания субстрата химическими денатурантами. Таким образом, возможность использования меток для деградации после стадии разворачивания демонстрирует, что для расщепляющегося белка необязательно, чтобы меченый конец первым входил в ClpP. Предварительные данные предполагают, что COOH-концевое удлинение GFP-RepA, обеспечиваемое гистидиновой меткой, может играть роль в эффективном разворачивании и деградации белка (неопубликованные наблюдения).Однако самого расширения His ₆ недостаточно, чтобы служить эффективным сигналом распознавания. Дальнейшая работа необходима для определения механизма деградации белков с внутренней меткой.

Наблюдение за тем, что ClpXP не полностью разлагает MuA-GFP, давая GFP плюс около 3 кДа COOH-концевой части MuA, согласуется с наблюдениями Lee et al. (22). Они обнаружили, что когда ClpAP и ClpXP сталкиваются с устойчивым к разворачиванию доменом, таким как DHFR, стабилизированный метотрексатом, неградиентный хвост из примерно 30 аминокислот остается прикрепленным к свернутому домену.Они предполагают, что 30 аминокислотных остатков могут быть длиной белка, необходимой для достижения от сайта транслокации субстрата на АТФазе Clp до протеолитической полости ClpP. Пептидный хвост, прикрепленный к GFP, который остается после деградации MuA-GFP под действием ClpXP, очень вероятно, включает 10-аминокислотный сигнал распознавания ClpX.

Настоящее исследование показывает, что ClpA распознает тег RepA из 15 аминокислот, когда он перемещается с NH ₂ — на конец COOH GFP. Более того, GFP-RepA (1-15) с COOH-концом деградирует значительно быстрее, чем RepA (1-15) -GFP с меткой NH ₂ на конце.Возможно, что белки Clp более эффективно перемещают субстраты в направлении COOH-to-NH ₂ , чем в обратном направлении. Однако, если есть предпочтение по направлению, оно должно быть небольшим, потому что ClpA и ClpX разрушают как субстраты, меченные на концах NH ₂ , так и COOH. На сегодняшний день способность белков Clp более эффективно перемещать субстраты в одном или другом направлении не отличается от присущей субстрату способности более эффективно разворачиваться с одного или другого конца.Настоящие результаты предполагают, что структура GFP, вероятно, легче разворачивается с помощью ClpA, когда метка расположена на конце COOH, чем когда она находится на конце NH ₂ , поскольку ограничивающая скорость стадия деградации ClpAP и ClpXP разворачивается (18, 19). Аналогичное предположение возникает из экспериментов с ClpXP, показывающих, что когда тег MuA является COOH-концом по отношению к GFP, часть GFP слитого белка разрушается, а когда тег MuA является NH ₂ -концевым по отношению к GFP, часть GFP является не деградировал.

Наша рабочая модель состоит в том, что распознавание субстрата с помощью ClpA включает относительно неструктурированный короткий аминокислотный сегмент, содержащий набор предпочтительных аминокислот, а не сегмент с уникальной трехмерной структурой. После связывания субстрата начинается разворачивание белка, даже если первичный мотив распознавания находится внутри первичной последовательности субстрата. Остается ответить на вопрос, разворачиваются ли подложки направленным или согласованным образом.После развертывания субстрат перемещается в полость ClpP, начиная либо с немаркированного конца, либо, что менее вероятно, из внутренней петли в развернутой полипептидной цепи.

Благодарности

Мы благодарим Suveena Sharma и Susan Gottesman за полезные комментарии.

Сокращения

• TCA, трихлоруксусная кислота

• GFP, зеленый флуоресцентный белок

• АТФ [γS], γ-тио-АТФ

• Copyright © 2002, Национальная академия наук

Министр внутренних дел по стандартам восстановления и иллюстрированным руководящим принципам восстановления исторических зданий — стандарты

Министр внутренних дел отвечает за установление стандартов для все программы в ведении ведомства и для консультирования федеральных агентств о сохранении исторической собственности, внесенной в список или имеющих право на листинг в Национальном реестре исторических мест.

Стандарты реабилитации (кодифицированы в 36 CFR 67 для использования в Федеральной программе налоговых льгот за сохранение исторического наследия) наиболее распространенное лечение. «Реабилитация» определяется как «процесс о возвращении собственности в состояние полезности путем ремонта или изменения, что делает возможным эффективное современное использование при сохранении тех части и особенности собственности, имеющие значение для ее исторической, архитектурные и культурные ценности.«

Первоначально разработан министром внутренних дел для определения целесообразности предлагаемых проектных работ по зарегистрированной собственности в Историческом Программа субсидий Фонда сохранения, Стандарты реабилитации широко использовались на протяжении многих лет — в частности, чтобы определить, требуется ли реабилитация квалифицируется как сертифицированная реабилитация для целей федерального налогообложения. Кроме того, Стандарты руководили федеральными агентствами в выполнении их исторических обязанности по сохранению собственности, находящейся в федеральной собственности или под контролем; и государственные и местные чиновники при рассмотрении как федеральных, так и нефедеральных предложения по реабилитации.Они также были приняты историческим районом. и комиссии по планированию по всей стране.

цель Стандартов — способствовать долгосрочному сохранению собственности значение благодаря сохранению исторических материалов и особенностей. Стандарты относятся к историческим зданиям из всех материалов, конструкции типы, размеры и заполняемость и охватывают внешний и внутренний здания.Они также охватывают связанные особенности ландшафта и строительная площадка и окружающая среда, а также прилегающие, смежные или связанные новое строительство. Чтобы быть сертифицированным для целей федерального налогообложения, реабилитация Секретарь должен определить проект, чтобы он соответствовал исторический характер строения (ов) и, если применимо, район в котором он находится.

As указано в определении, лечение «реабилитация» предполагает, что потребуется хоть какой-то ремонт или переделка исторического здания чтобы обеспечить эффективное современное использование; однако эти ремонт и изменения не должны приводить к повреждению или разрушению материалов и деталей. или отделки, которые важны для определения исторического характера здания.Например, некоторые виды лечения — при неправильном применении — могут вызвать или ускорить физический износ исторического здания. Это может включать использование неправильная переналадка или очистка наружной кладки, или введение изоляция, которая повреждает историческую ткань. Почти во всех этих ситуациях использование этих материалов и обработок приведет к проекту, который не соответствуют стандартам. Точно так же внешние дополнения, которые дублируют форма, материал и детализация конструкции в той степени, в которой они компромисс исторический характер конструкции не будет соответствовать Стандарты.

Министр внутренних дел по стандартам реабилитации

Стандарты (правила Министерства внутренних дел, 36 CFR 67) относятся к историческим здания из всех материалов, типов конструкций, размеров и вместимости, а также охватывают экстерьер и интерьер, связанные с ними ландшафтные особенности и участок и окружение здания, а также прилегающие, прилегающие или родственное новое строительство.Стандарты должны применяться к конкретным проекты реабилитации разумным образом, принимая во внимание экономическая и техническая осуществимость.

1. Имущество используется по своему историческому назначению или помещается в новое здание. использование, которое требует минимального изменения определяющих характеристик здание, его участок и окружающая среда.

2. Исторический характер собственности сохраняется и сохраняется.Удаление исторических материалов или изменение функций и пространств которые характеризуют свойство, следует избегать.

3. Каждое имущество признается как вещественная запись о его времени, месте, и пользуйся. Изменения, создающие ложное ощущение исторического развития, например, добавление предположительных особенностей или архитектурных элементов из других постройки, предприниматься не будут.

4.Большинство свойств со временем меняются; те изменения, которые приобрели исторический самостоятельное значение должно быть сохранено и сохранено.

5. Отличительные особенности, отделка и методы строительства или примеры мастерства, характеризующего собственность, должны быть сохранены.

6. Изношенные исторические объекты подлежат ремонту, а не замене.Если серьезность ухудшения требует замены отличительного функция, новая функция должна соответствовать старому по дизайну, цвету, текстуре, и другие визуальные качества и, по возможности, материалы. Замена отсутствие признаков должно быть подтверждено документально, физически или наглядное свидетельство.

7. Химическая или физическая обработка, например пескоструйная обработка, вызывающая повреждение к историческим материалам не должны использоваться.Очистка поверхностей конструкций, при необходимости, должны проводиться как можно более щадящими средствами.

8. Значительные археологические ресурсы, затронутые проектом, должны быть защищены. и сохранились. Если такие ресурсы должны быть нарушены, меры по смягчению должны быть предприняты.

9. Новые дополнения, внешние изменения или связанные с ними новые постройки должны не разрушать исторические материалы, характеризующие собственность.Новый работа должна отличаться от старой и быть совместимой с массивность, размер, масштаб и архитектурные особенности для защиты исторического целостность собственности и окружающей среды.

10. Должны быть выполнены новые пристройки и прилегающее или связанное новое строительство таким образом, чтобы в случае удаления в будущем основная форма и целостность исторической собственности и окружающей среды не будет нарушена.

Вот раздвижной интерьер нового Hyundai Ioniq 5

.

Hyundai дразнит первые фотографии интерьера Ioniq 5 перед его мировой премьерой 23 февраля. Это первый электромобиль Hyundai, использующий модульную платформу Electric-Global (E-GMP) — ту же платформу, в которой Apple, как говорят, была заинтересована в своем беспилотном автомобиле, о котором часто ходят слухи. Плоский аккумулятор E-GMP и длинная колесная база позволяют сделать салон более просторным и настраиваемым как для пассажиров, так и для груза.

Большой дизайн, о котором мы расскажем сегодня, — это сдвижная центральная консоль внутри Ioniq 5. Так называемый «Универсальный остров» отодвигается в сторону, так что водитель или пассажиры могут легко входить и выходить с любой стороны автомобиля, когда он припаркован на стоянке. узкое место, например.

«Универсальный остров» съезжает с дороги. GIF: Hyundai

Hyundai сообщает, что сиденья водителя и переднего пассажира оборудованы подставками для ног, чтобы расслабиться во время зарядки автомобиля.Сиденья также можно переставить, чтобы взрослые, находящиеся впереди, могли заботиться о домашних животных и детях, сидящих сзади. Hyundai отмечает, что интерьер Ioniq 5 будет отделан экологически чистыми материалами.

Тизер Ioniq 5 в преддверии мировой премьеры. Изображение: Hyundai

В Ioniq 5, похоже, есть режим Tesla Camp Mode с функцией, которая эффективно превращает автомобиль в катящийся генератор с 3.5 кВт мощности от транспортного средства к нагрузке (V2L). Этого заряда достаточно для питания мощных приборов на 110/220 В, таких как полноразмерная духовка, беговая дорожка или пять гигантских динамиков, как уже дразнила Hyundai. Teslas не сможет этого сделать, не взломав инвертор в схему и не аннулируя вашу гарантию. Ioniq оснащен розетками V2L внутри и снаружи автомобиля.

Домкрат V2L на внутренней стороне. … и снаружи.

Другие известные возможности Ioniq 5 включают сверхбыструю зарядку, которая позволяет ему проехать более 100 км (62 миль) после 5-минутной зарядки. Hyundai ранее заявлял, что автомобили E-GMP смогут проехать более 500 км (310 миль) без подзарядки.

Мировая премьера

Hyundai Ioniq 5 состоится 22 февраля в 23:00 по калифорнийскому времени или в 8:00 в Германии утром 23 числа.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

---

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с вашим системным администратором.

---

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

---

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.